菘蓝CYP83A1基因的克

发布时间：2019-11-01 05:57

【摘要】：本研究对菘蓝CYP83A1基因进行了克隆、表达特性及原核表达研究。结果表明,IiCYP83A1基因组DNA全长为1 622 bp,包含2个外显子和1个内含子;cDNA全长为1 512 bp,编码503个氨基酸。IiCYP83A1编码的蛋白包含2个跨膜结构域,无信号肽,主要定位于内质网膜,属于亲水性蛋白,二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成,与萝卜、欧洲油菜、西兰花和芜菁等植物的CYP83A1蛋白具有较高的同源性。qRT-PCR结果表明,IiCYP83A1在不同组织中的表达具有显著性差异,表现为茎叶果花和根;在幼苗期、生长期和花期的表达量显著高于萌芽期;茉莉酸甲酯(MeJA)和伤害处理能够显著促进该基因的表达,而低温(4℃)和水杨酸(SA)处理则对其表达具有一定的抑制作用。将克隆到的IiCYP83A1基因连接到表达载体pET-28a上,构建原核表达载体pET-28a-IiCYP83A1并对其进行原核表达。SDS-PAGE结果显示,在E.coli BL21中成功诱导表达了CYP83A1蛋白,与预期蛋白分子量大小一致。本研究结果可为进一步研究IiCYP83A1的功能提供实验依据。
【图文】：

结构域,α-螺旋,无规则,氨基酸序列

软件预测IiCYP83A1蛋白的二级结构，结果表明该蛋白的二级结构中α-螺旋(alphhahelix)所占比例为46.52%，无规则卷曲螺旋(randomcoil)所占比例为31.41%，而延伸链(extendedstrand)所占比例为12.72%，β-转角(β-turn)所占比例为9.34%。因此，α-螺旋和无规则卷曲螺旋是I-iCYP83A1的主要结构元件，而延伸链分布在整个蛋白质结构中。利用SwissModel程序同源构建模型预测该蛋白的三维结构模型(图4)，IiCYP83A1三级结构中α-螺旋和无规则卷曲所占比例较高，其次为延伸链，与其二级结构预测的结果相一致。图3IiCYP83A1蛋白的功能结构域Figure3FunctionaldomainanalysisofIiCYP83A11.5IiCYP83A1同源蛋白的多序列比对及系统进化树利用NCBI中的BLASTP程序，分析IiCYP83A1与其他植物CYP83A1的氨基酸同源性。结果表明：菘蓝CYP83A1氨基酸序列与芜菁(Brassicarapa,XP_009139598.1)、欧洲油菜(Brassicanapus,NP_001-303017.1)、西兰花(Brassicaoleracea,AIK28472.1)和萝卜(Raphanussativus,AHB11194.1)的氨基酸序列相似性均为95%；与芥菜(Brassica_juncea,AGO377-57.1)、深山拟南芥(Arabidopsislyrata,XP_0028683-39.1)、拟南芥(Arabidopsisthaliana,NP_193113.1)及天蓝遏蓝菜(Noccaeacaerulescens,JAU56242.1)的氨基酸序列相似性分别为92%、87%、87%和85%。多序列比对结果表明：菘蓝CYP83A1与其他8种植物的CYP83A1结构类似，均具有保守的血红素结合域(Heme-bindingmotif,FxxGxRxCxG序列)和氧结合域(A/G)Gx(D/E)T(T/S)，并含有两个P450s的标志性序列：PERF和KETLR(K-helix)(图5)。此外，利用ClustalX1.8和MEGA5.0对IiCYP83A1氨基酸序列与GenBank上注册的其他物种CYP83A1的氨基

三级结构,菘蓝

发育阶段的表达特性。结果显示：IiCYP83A1在菘蓝的根、茎、叶、花和果中均有表达，且以茎中表达量最高，为根中表达量的64倍，其次是叶和果，分别是根中表达量的41和24倍，而根和花中表达量较低(图7A)。IiCYP83A1在菘蓝幼苗期、生长期和花期均有表达，且显著高于萌芽期(图7B)。为了探究IiCYP83A1在逆境胁迫下的表达特性，本研究利用qRT-PCR分析了4种非生物胁迫(MeJA,SA,低温和伤害)处理下菘蓝幼苗中IiCYP8-3A1的表达模式。结果显示，，在MeJA处理条件下(图7C)，IiCYP83A1表达量伴随处理时间的延长呈图4IiCYP83A1蛋白的三级结构预测Figure4Predicted3DstructuremodelofIiCYP83A1305

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