RNAi靶向沉默CDX2基因表达联合长春新碱对白血病细胞增殖、凋亡的影响

发布时间：2019-11-01 22:22

【摘要】：目的:筛选有效、特异性shRNA序列,使其能够特异性沉默白血病细胞CDX2基因表达,进一步研究CDX2沉默表达联合长春新碱共同作用于白血病细胞时,细胞增殖、凋亡的变化,并探讨其可能的作用机制,探索靶向沉默CDX2基因联合化疗药物治疗白血病的新思路。方法:1.设计合成针对CDX2不同编码区的4组CDX2-shRNA :CDX2-shRNA-1443, CDX2-shRNA-2008, CDX2-shRNA-921 和阴性对照序列CDX2-shRNA-NC,应用脂质体转染法分别转染人结肠癌细胞株SW620,应用Real-time PCR、Western-Blot法检测各组shRNA转染SW620细胞后,目的基因CDX2mRNA和蛋白的表达量变化,筛选出一组shRNA序列,使其对CDX2基因表达沉默效率最佳,进一步通过细胞增殖、凋亡实验检测转染shRNA前后SW620细胞增殖、凋亡的变化,用于下一步实验。2.将筛选得到的CDX2-shRNA序列以及阴性对照序列分别转染人慢性粒细胞白血病细胞株K562,通过Real-time PCR、Western-Blot法检测转染前后CDX2基因表达量变化,并进一步检测BCR-ABL、Caspase-9等凋亡关键蛋白的表达量变化;进一步通过细胞增殖、凋亡实验检测,沉默CDX2基因表达后对白血病细胞增殖、凋亡的变化。3.将CDX2-shRNA与经典化疗药物共同作用于白血病细胞,Real-time PCR、Western-Blot检测CDX2基因表达量变化,进一步检测二者共同作用对白血病细胞增殖和凋亡的影响;同时检测BCR-ABL、Caspase-9、Bax mRNA和蛋白的表达量变化,探讨其可能的作用机制。结果:1.设计合成的4组CDX2-shRNA序列中,CDX2-shRNA-921抑制CDX2基因表达的效果最显著,与正常细胞组相比,CDX2mRNA和蛋白表达量分别下降66.2% (P0.05)和68.2% (P0.01),差别均有统计学意义;而阴性对照组CDX2 mRNA和蛋白表达量分别为0.720±0.084vs0.917±0.063,0.752±0.008vs0.798±0.013,差别均无统计学意义;细胞增殖、凋亡实验结果显示:转染CDX2-shRNA-921组细胞增殖抑制率在不同时间点均明显高于正常细胞组,而细胞凋亡率为10.5%vs28.4%,差别均有统计学意义。提示本研究成功筛选出对沉默CDX2基因表达沉默效率最佳的CDX2 shRNA序列,所合成阴性对照序列与人类基因组无同源性,可用于下一步实验。2.将CDX2-shRNA-921和阴性对照序列CDX2-shRNA-NC分别转染人慢性粒细胞白血病细胞株K562后,CDX2基因表达量明显降低,mRNA和蛋白表达量与正常细胞组相比分别下降60.5%和47.7%。进一步检测相关凋亡蛋白可知,沉默CDX2基因表达后,Survivin表达量明显降低,Caspase-9、Bax的表达量明显增高。转染CDX2-shRNA-921组细胞增殖抑制率和凋亡率较正常细胞组和转染CDX2-shRNA-NC组明显增加。3.将CDX2-shRNA-921与长春新碱(VCR)联合作用于K562细胞,MTT法和流式细胞术检测细胞增殖、凋亡情况可知,CDX2-shRNA-921+VCR联合作用组与细胞对照组、阴性对照细胞组、VCR组和CDX2-shRNA-921组的细胞增殖抑制率、凋亡率差异比较均有统计学意义。结论:1.实验筛选的CDX2-shRNA序列能够有效沉默CDX2基因表达,也能使人结肠癌细胞SW620增殖受抑、凋亡增加。2.实验筛选的CDX2-shRNA序列在白血病细胞中同样存在类似作用,能够有效沉默白血病细胞K562内CDX2基因表达,同时能够显著抑制K562细胞增殖并促进凋亡,其机制可能是激活细胞内多种与凋亡相关的信号通路实现的。3.转染CDX2-shRNA载体联合长春新碱后,K562细胞的增殖能力减弱,凋亡率显著增加,即沉默CDX2基因表达后,K562细胞对长春新碱的药物敏感性显著增强。
【图文】：

蛋白表达量下降最为显著（６８％），差别有统计学意义（Ｐ＜０．００１），逡逑ＣＤＸ２－ｓｈＲＮＡ－ＮＣ组ＣＤＸ２蛋白表达量（０．７５２±０．００８）与未转染细胞组逡逑（０．７９８±０．０１３）比较差异无统计学意义，Ｐ＞０．０５。见图１－２。本结果与逡逑Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ邋ＰＣＲ结果相符，提示本实验成功筛选出能够特异性有效沉默逡逑ＳＷ６２０细胞ＣＤＸ２基因表达的ｓｈＲＮＡ序列

灄邋ｉｉＪｌ逡逑，／逦＃令０七逡逑图１－２邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ法检测各处理组ＣＤＸ２蛋白表达水平变化逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｔｈｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ＣＤＸ２邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｉｎ邋ｅａｃｈ邋ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ邋ｇｒｏｕｐ邋ｄｅｔｅｃｔｅｄ邋ｂｙ逡逑Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ逡逑Ｆｉｇ．邋１－２：邋Ｔｈｅ邋ｒｅｌａｔｉｖｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ＣＤＸ２邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｉｎ邋Ｋ５６２邋ｃｅｌｌｓ邋ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ逡逑ｓｈＲＮＡｓ（ｄｅｔｅｃｔｅｄ邋ｂｙ邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ）．邋１４４３：邋Ｋ５６２邋ｃｅｌｌｓ邋ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ邋ｗｉｔｈ逡逑ＣＤＸ２－ｓｈＲＮＡ－１４４３；邋２００９：邋Ｋ５６２邋ｃｅｌｌｓ邋ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ＣＤＸ２－ｓｈＲＮＡ－２００９；邋９２１：邋Ｋ５６２逡逑ｃｅｌｌｓ邋ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ＣＤＸ２－ｓｈＲＮＡ－９２１；邋ＮＣ：邋Ｋ５６２邋ｃｅｌｌｓ邋ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ邋ｗｉｔｈ逡逑ＣＤＸ２－ｓｈＲＮＡ－ＮＣ邋ａｓ邋ａ邋ｎｅｇａｔｉｖｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ；邋Ｋ：邋Ｕｎｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ邋Ｋ５６２邋ｃｅｌｌｓ邋ａｓ邋ａ邋ｂｌａｎｋ邋ｃｏｎｔｒｏｌ．逡逑＊＊＊：邋Ｐ＜０．００５，邋ｃｏｍｐａｒｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ｂｌａｎｋ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ．逡逑１．３．３邋ＣＤＸ２邋ｓｈＲＮＡ对ＳＶ／６２０细胞增殖育ｇ力的影响逡逑ＭＴＴ结果显示：与ＣＤＸ２－ｓｈＲＮＡ－ＮＣ组和正常细胞组比较，转染６ｈ，，逡逑１２ｈ、１８ｈ、３６ｈ、５４ｈ、７２ｈ，转染ＣＤＸ２－ｓｈＲＮＡ－９２１组细胞增殖能力明显减逡逑弱
【学位授予单位】：滨州医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R733.7

【参考文献】

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1 裴卫z

本文编号：2554168