苹果液泡膜葡萄糖转运蛋白基因MdVGT1的克隆与表达分析
发布时间：2019-11-06 03:08
【摘要】：【目的】研究新疆红肉苹果杂种一代优系‘红脆1号’液泡膜葡萄糖转运蛋白基因MdVGT1生物学信息、表达水平及其在糖代谢中的功能,旨在为进一步完善功能型苹果育种的理论与技术体系提供参考。【方法】以新疆红肉苹果杂种一代优系‘红脆1号’为试材,克隆MdVGT1,对其进行生物信息学分析;并采用荧光定量PCR分析该基因在不同组织及不同发育时期的表达,分析‘嘎啦’组培苗中该基因在葡萄糖诱导下的表达,通过酵母双杂交验证其互作关系,并通过原核诱导获得重组蛋白。【结果】在‘红脆1号’中克隆获得MdVGT1全长,测序发现其包含1 506 bp完整的开放阅读框,编码501个氨基酸,预测其编码蛋白质分子量为53.16 kD,等电点为5.92,定位于苹果基因组的1号染色体上,由14个外显子和13个内含子构成;糖代谢相关基因系统进化树分析表明,MdVGT1与AtVGT1、VvVGT1、CsVGT1在同一个进化枝上,功能域分析表明,MdVGT1蛋白含有12个跨膜区域;MdVGT1在苹果的花、叶和幼果中均有较高的表达,在果实发育中,其表达量与葡萄糖含量有显著的相关性;MdVGT1启动子含有与抗逆、糖信号及激素信号相关的顺式作用元件;葡萄糖处理‘嘎啦’组培苗一周后,MdVGT1的表达量明显提高;酵母双杂交试验表明,MdVGT1与MdTMT1在体外能相互作用,并通过原核诱导获得了MdVGT1的重组蛋白。【结论】在‘红脆1号’苹果中克隆获得了液泡膜葡萄糖转运蛋白基因MdVGT1,其可能与MdTMT1互作共同转运葡萄糖进入液泡膜。
【图文】：
进行双酶切，构建原核重组表达载体pET28a-MdVGT1，将重组质粒转化到大肠杆菌DE3感受态中。加入1mmol·L-1IPTG后分别在0、2、4、6h时取样于4℃暂时保存，取6h菌液离心收集菌体，用8mLPBS缓冲液悬浮，超声破碎（打6s，停9s，25个循环）分离可溶性蛋白和包涵体，SDS-PAGE电泳检测。1.7数据分析用Excel2007进行作图和数据分析，DPS7.05软件进行显著性分析，Spss进行相关性分析。2结果2.1MdVGT1的克隆与基因组结构分析如图1所示，获得了一条大小约为1500bp的条带，，与预期大小一致，序列测定与分析表明，MdVGT1图1MdVGT1编码区全长的RT-PCR扩增Fig.1AgarosegelelectrophoresisofMdVGT1RT-PCRproducts
蛋白基因MdVGT1的克隆与表达分析4587的完整开放阅读框长度为1506bp，编码501个氨基酸，预测其蛋白质分子量为53.16kD，等电点为5.92。利用GDR数据库（http：//www.rosaceae.org/）分析MdVGT1的染色体位置和基因结构。如图2所示，MdVGT1位于苹果基因组的1号染色体上，由14个外显子和13个内含子构成。2.2MdVGT1的进化树和结构功能域如图3所示，液泡单糖转运蛋白TMT和蔗糖转运蛋白SUT/SUC分别在不同物种间都在同一个进化树枝上，因其具有相同的功能。而MdVGT1和拟南芥AtVGT1同样在同一个进化树枝上，推测苹果MdVGT1图2MdVGT1染色体定位和基因组结构Fig.2ChromosomallocationandgenomicstructureoftheMdVGT1图3糖代谢相关转运蛋白系统进化树分析Fig.3Phylogenetictreeofrelativetransporteringlycometabolism与拟南芥AtVGT1的功能相似（图3中比例尺0.1代表每10个氨基酸有1个不同）。SMART功能域分析表明MdVGT1有12个跨膜区域。2.3MdVGT1组织表达特性及果实发育过程中MdVGT1表达量与葡萄糖含量相关性由图4可得，MdVGT1在根、茎、叶、花、果实中都有表达，其中在叶、花和果实中具有较高的表达。由图5可得，MdVGT1表达量和葡萄糖含量均在花后120d达到最大值，经Spss显著性分析可得，MdVGT1表达量和葡萄糖含量在0.05水平上显著相关（显著性系数为0.986）。2.4MdVGT1启动子顺式作用元件和葡萄糖处理‘嘎啦’组培苗MdVGT1的表达利用https://sogo.dna.affrc.go.jp/cgi-bin/sogo.cgi?sid=&lang=en&pj=640&action=page&page=newplace网址分析MdVGT1启动子的顺式作用元件，结果如表1。MdVGT1启动子序列含有多个与抗逆性相关的作用元件：ACGTATERD1和MYBCORE是与脱水相关的元件[19-21]，MYB1LEPR是与防御相关的元件[22]，
本文编号：2556494
【图文】：
进行双酶切，构建原核重组表达载体pET28a-MdVGT1，将重组质粒转化到大肠杆菌DE3感受态中。加入1mmol·L-1IPTG后分别在0、2、4、6h时取样于4℃暂时保存，取6h菌液离心收集菌体，用8mLPBS缓冲液悬浮，超声破碎（打6s，停9s，25个循环）分离可溶性蛋白和包涵体，SDS-PAGE电泳检测。1.7数据分析用Excel2007进行作图和数据分析，DPS7.05软件进行显著性分析，Spss进行相关性分析。2结果2.1MdVGT1的克隆与基因组结构分析如图1所示，获得了一条大小约为1500bp的条带，，与预期大小一致，序列测定与分析表明，MdVGT1图1MdVGT1编码区全长的RT-PCR扩增Fig.1AgarosegelelectrophoresisofMdVGT1RT-PCRproducts
蛋白基因MdVGT1的克隆与表达分析4587的完整开放阅读框长度为1506bp，编码501个氨基酸，预测其蛋白质分子量为53.16kD，等电点为5.92。利用GDR数据库（http：//www.rosaceae.org/）分析MdVGT1的染色体位置和基因结构。如图2所示，MdVGT1位于苹果基因组的1号染色体上，由14个外显子和13个内含子构成。2.2MdVGT1的进化树和结构功能域如图3所示，液泡单糖转运蛋白TMT和蔗糖转运蛋白SUT/SUC分别在不同物种间都在同一个进化树枝上，因其具有相同的功能。而MdVGT1和拟南芥AtVGT1同样在同一个进化树枝上，推测苹果MdVGT1图2MdVGT1染色体定位和基因组结构Fig.2ChromosomallocationandgenomicstructureoftheMdVGT1图3糖代谢相关转运蛋白系统进化树分析Fig.3Phylogenetictreeofrelativetransporteringlycometabolism与拟南芥AtVGT1的功能相似（图3中比例尺0.1代表每10个氨基酸有1个不同）。SMART功能域分析表明MdVGT1有12个跨膜区域。2.3MdVGT1组织表达特性及果实发育过程中MdVGT1表达量与葡萄糖含量相关性由图4可得，MdVGT1在根、茎、叶、花、果实中都有表达，其中在叶、花和果实中具有较高的表达。由图5可得，MdVGT1表达量和葡萄糖含量均在花后120d达到最大值，经Spss显著性分析可得，MdVGT1表达量和葡萄糖含量在0.05水平上显著相关（显著性系数为0.986）。2.4MdVGT1启动子顺式作用元件和葡萄糖处理‘嘎啦’组培苗MdVGT1的表达利用https://sogo.dna.affrc.go.jp/cgi-bin/sogo.cgi?sid=&lang=en&pj=640&action=page&page=newplace网址分析MdVGT1启动子的顺式作用元件，结果如表1。MdVGT1启动子序列含有多个与抗逆性相关的作用元件：ACGTATERD1和MYBCORE是与脱水相关的元件[19-21]，MYB1LEPR是与防御相关的元件[22]，
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本文编号：2556494
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