油菜高效再生体系的建立及草甘膦抗性基因EPSPs和BnGRF2的遗传转化

发布时间：2019-11-06 23:08

【摘要】：油菜属十字花科(Cruciferae)芸薹属(Brassica),是我国重要的油料作物之一。随着国际竞争日趋激烈,我国油菜生产还面临许多挑战,高含油率油菜种植资源尤为稀缺。长调节因子生(growth-regulating factor,GRF)作为一种转录因子对植物生长发育起着重要的调节作用。已有研究证明,油菜生长调节因子BnGRF2可提高转化的拟南芥种子含油量,同时增加粒重,但BnGRF2调控油菜的研究尚未见报道。此外,杂草危害是限制油菜产业发展的因子之一,伴随着我国农村劳动力的日益紧缺,靠人工除草已不能满足油菜生产的需求,并且增加了生产成本。因此,本研究通过转基因手段将BnGRF2和草甘膦抗性基因EPSPs应用于油菜,对于确定BnGRF2在油菜种子发育和油脂合成中的作用、双价基因对油菜生长的影响具有一定的理论意义,也为同时获得提高种子含油量和具有除草剂抗性的新型油菜种质资源奠定了基础。本文以甘蓝型油菜品种“青杂5号”恢复系“1831R”(简称QZ-1831R)和白菜型油菜品种H165的下胚轴和叶片为研究对象,设置不同浓度的6-BA和2,4-D,6-BA和GA3的正交试验,从中选择出适于甘蓝型油菜和白菜型油菜下胚轴与叶片诱导愈伤和芽再生培养基。在此基础上,以8个品种(系)为试验材料,研究不同基因型对再生体系的影响。以筛选出的较优4种基因型为研究对象,设计5个NAA/IAA的浓度梯度,选择适于甘蓝型和白菜型油菜生根的NAA/IAA浓度。此外,本研究在农杆菌介导法的基础上,探究不同时间处理的超声波法和不同真空渗透压力真空渗透法对转化的影响。同时,本研究使用了最适于转化过程中脱除农杆菌的不同浓度梯度的四种抗生素(羧苄青霉素(Carb)、阿莫西林(Cav)、头孢霉素(Cef)、特美汀(Tim))。取得的主要结果如下:1.油菜高频再生体系影响要素的探究(1)最适于QZ-1831R下胚轴和叶片的愈伤诱导培养基中6-BA的浓度为2 mg·L~(-1),2,4-D的浓度为0.5 mg·L~(-1);最适于H165下胚轴和叶片的愈伤诱导中6-BA的浓度为2 mg·L~(-1),2,4-D的浓度为1.0 mg·L~(-1)。最佳的芽再生培养基中6-BA的浓度均为4 mg·L~(-1),GA3均的浓度为1.5 mg·L~(-1)。因此,可在甘蓝型油菜的愈伤诱导培养基中加入2 mg·L~(-1) 6-BA,0.5 mg·L~(-1)2,4-D;在白菜型油菜的愈伤诱导培养基中加入2 mg·L~(-1) 6-BA,1.5 mg·L~(-1) 2,4-D;在芽再生培养基中可加入4 mg·L~(-1) 6-BA,1.5 mg·L~(-1) GA3。(2)不同的基因型对植株再生的影响不一。下胚轴愈伤诱导率由高到底依次为QZ-1831RH165LY-C20QZ-482RGZ-3219RH403-3H403-2;叶片愈伤诱导率依次为GZ-3219RH403-3QZ-1831R≥QZ-482RLY-C20≥H165H403-2。芽再生中,甘蓝型油菜品种的下胚轴及叶片的芽再生率均高于白菜型。表明基因型对油菜再生能力有很大影响,同时甘蓝型油菜中表现最好的为QZ-1831R和GZ-3219R,白菜型油菜中表现最好的为H165和H403-3。(3)最适于QZ-1831R、GZ-3219R的最优生根培养基为1/2MS+0.2 mg·L~(-1) NAA(0.4mg·L~(-1) IAA);H165、H403-3的最优生根培养基为1/2MS+0.5 mg·L~(-1)(NAA/IAA)。说明甘蓝型油菜较白菜型油菜易生根。2.农杆菌介导的遗传转化及分子检测(1)对农杆菌介导和超声波或真空渗透转化法以及抗生素脱菌效果进行了研究,结果表明超声波处理15 s为宜;真空渗透压力为0.05 Mpa,时间为2 min时,下胚轴及叶片的转化效率明显优于其它处理;抗生素浓度在500-600 mg·L~(-1)下,均可有效抑制农杆菌的生长,抗生素浓度低于500 mg·L~(-1)时,Carb抑菌效果最好,但是芽再生阶段300 mg·L~(-1)的Cav处理下芽再生能力最强。(2)经草甘膦抗性筛选及PCR初步检测,甘蓝型油菜中QZ-1831R的下胚轴和叶片转化率最高,分别为4.83%、4.98%;白菜型油菜品种中H403-2的下胚轴及叶片转化率最高,分别为4.4%、4.2%。(3)对转基因油菜T1代植株进行qRT-PCR检测分析,结果表明:除QZ-1831R外,其余6个品种中BnGRF2表达量显著高于对照植株。研究BnGRF2对7个转基因品种含油量和千粒重的影响,发现除QZ-1831R外,甘蓝型品种GZ-3219R、QZ-482R、LY-C20,白菜型品种H165、H403-2、H403-3的含油量和千粒重显著高于WT。
【图文】：

32由图 2A 所示，不同浓度和配比的 6-BA，2,4-D 对诱导甘蓝型和白菜型油菜的生愈伤的能力不同。对 QZ-1831R，当 6-BA 浓度为 1 mg L-1时，随着 2,4-D 浓度的增加愈伤诱导率6-BA 浓度为 2 mg L-1时，随着 2,4-D 浓度的增加愈伤诱导率先递增后降低；当 6-B3 mg L-1时，随着 2,4-D 浓度的增加愈伤诱导率趋于稳定但低于 2 mg L-16-BA 的处浓度配比为 2 mg L-16-BA+0.5 mg L-12,4-D 时，与其它处理下的愈伤诱导结果差异伤诱导率达到 96.7%，其次为 2 mg L-16-BA+1.0 mg L-12,4-D 处理、3 mg L-16-BA+2,4-D 处理，愈伤诱导率依次高出 4.8%、16.0%。说明 6-BA，2,4-D 浓度都较低时诱导效果不明显，最佳激素组合为 2 mg L-16-BA+0.5 mg L-12,4-D。对 H165，当 6-BA 浓度为 1 mg L-1时，，随着 2,4-D 浓度的增加愈伤诱导率递增浓度为 2 mg L-1时，随着 2,4-D 浓度的增加，愈伤诱导率无明显变化；当 6-BA 浓度为

甘肃农业大学 2017 届硕士毕业论文hghfgfedcbb baabbbbihggfedcdbcbabcde eee0.0%10.0%20.0%30.0%40.0%50.0%60.0%70.0%再生率（芽%）Shootergenearitonaret不同植物激素组合对下胚轴芽再生的影响Effects of different phytohormone combinations on Hypocotyl regeneration1831R H165A
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S565.4

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本文编号：2556965