利用CRISPR-Cas9系统进行水稻OsMADS15基因的定向编辑
发布时间：2019-11-14 00:33
【摘要】：CRISPR-Cas9系统的发现和应用为快速、定向的植物基因组编辑、突变体创制和开展植物功能基因组研究提供了新的技术工具。在本研究中,我们利用CRISPR-Cas9系统,对水稻A类MADS-box转录基因Os MADS15进行定点基因组编辑。结果显示,该体系在T_0代即获得3个不同的9522~(Osmads15)双等位突变株系:株系9522~(Osmads15-1)等位1在靶点缺失1个碱基A,等位2在靶点缺失3个碱基ACA;株系9522~(Osmads15-2)等位1在靶点缺失5个碱基CAACA,等位2在靶点缺失3个碱基CAA;株系9522~(Osmads15-3)等位1在靶点缺失1个碱基A;等位2发生了大片段的替换。所有株系等位1的突变均造成了开放阅读框移码,导致翻译提前终止;等位2的突变也使氨基酸序列发生不同程度的变化。初步的表型分析显示,9522~(Osmads15)突变体小穗不育外稃变长如叶状,并表现出生殖生长向营养生长的转变;与已报道的中籼3037~(dep)突变体表型不同,除9522~(Osmads15-2)株系外,其他2个株系内稃及生殖器官也有向叶片转换的趋势。q RT-PCR分析显示,3个突变株系的Os MADS15转录本水平显著降低。因此,本研究对Os MADS15基因第一外显子区域的靶点进行了高效的定点编辑,获得的9522~(Osmads15)突变体为进一步开展OsMADS15调控水稻小穗发育的遗传学和调控网络研究提供了新的遗传材料。
【图文】：
体的表型观察显示,与前人的研究结果相似,9522Osmads15突变体营养期生长正常,仅在生殖生长期具有明显的异常表型,所有9522Osmads15突变株系小穗均出现不同程度的异常发育性状。野生型9522小穗生长于一次枝梗和二次枝梗上(图3-A),外轮由不育外稃、外稃、内稃组成,不育外稃短缩,外稃与内稃紧密相扣(图3-B)。而9522Osmads15-1突变体23.5%(4/17)分蘖的一次枝梗转变为叶状器官(图3-C),其上生长的小穗不育外稃细长如叶状(图3-D),13.6%(47/345)的小穗在基部有根状结构出现(图3-D),这类小穗内轮器官也发育异常,少量图1OsMADS15基因结构及pCH-M15构建示意图Fig.1SchematicdiagramofOsMADS15genestructureandpCH-M15vectorA:OsMADS15基因结构及靶点位置。MADS:MADS-box结构域;AGG:前间区序列邻近基序(protospaceradjacentmotif,PAM);黑色线条为内含子。B:pCH-M15(pBin-sgR-Cas-OsCH-OsMADS15-T1)载体。两条直线位置即为靶序列插入位置。pOsU3:启动sgRNA转录的U3启动子;pOsUbi:水稻ubiquitin启动子,用以启动Cas9转录;NLS:核定位序列(nuclearlocalizationsequence);35S:启动抗性基因转录的烟草35S启动子;H+:潮霉素抗性基因;K+:卡那霉素抗性基因。
宋凡等:利用CRISPR-Cas9系统进行水稻OsMADS15基因的定向编辑973图2水稻转化植株的检测及突变型分析Fig.2DetectionoftransgenicriceplantsandmutationvariantsA:pBin-sgR-Cas-OsCH载体元件的PCR检测。M:Marker;1~4:载体元件存在的阳性植株;WT:元件不存在的野生型植株。B:9522Osmads15靶位点测序示意图及3种突变情况。AGG表示PAM;D1、D3、D5分别表示缺失1、3、5个碱基;Osmads15-3(反向)表示OsMADS15R引物反向测序结果,TTGAAGCAA表示该序列与原序列不同。C:OsMADS15蛋白的4个结构域(MADS、I、K、C)。灰色横虚线填充部分表示该段氨基酸序列与野生型不同;白色部分表示缺失。小穗心皮伸出内外稃变成幼苗状器官(图3-E),多层稃状结构取代了内轮的浆片、雄蕊和雌蕊器官(图3-F)。另外,虽然此株系中内稃结构也出现异常,但与已报道的dep突变体表型不同,我们未在此株系内发现内稃退化现象,相反,突变体内稃较外稃更长(图3-E)。9522Osmads15-3株系小穗异常生长表型与9522Osmads15-1株系类似,小穗由叶/稃状器官组成,且在基部有根状器官着生,但器官长度小于9522Osmads15-1株系(图3-G)。与9522Osmads15-1和9522Osmads15-3株系小穗表型不同,9522Osmads15-2株系小穗具有正常的内轮浆片、雄蕊和雌蕊器官(图3-H),但不育外稃和内稃器官同样更为细长;有趣的是,该株系中既有内稃较外稃变长的小穗(图3-H),也有内稃退化的小穗(图3-I),且在部分小穗内稃和不育外稃之间出现一个额外的稃状结构(图3-I)。OsMADS15基因转录水平分析显示,在突变体株系的内外稃组织中OsMADS15基因的转录水平显著下降(图3-J)。5突变植株9522Osmads15石蜡切片分析为了进一步观察分析突变植株异常稃状结构的细胞学属性,我们分别对3个株系进行了石蜡切片观察
本文编号：2560554
【图文】：
体的表型观察显示,与前人的研究结果相似,9522Osmads15突变体营养期生长正常,仅在生殖生长期具有明显的异常表型,所有9522Osmads15突变株系小穗均出现不同程度的异常发育性状。野生型9522小穗生长于一次枝梗和二次枝梗上(图3-A),外轮由不育外稃、外稃、内稃组成,不育外稃短缩,外稃与内稃紧密相扣(图3-B)。而9522Osmads15-1突变体23.5%(4/17)分蘖的一次枝梗转变为叶状器官(图3-C),其上生长的小穗不育外稃细长如叶状(图3-D),13.6%(47/345)的小穗在基部有根状结构出现(图3-D),这类小穗内轮器官也发育异常,少量图1OsMADS15基因结构及pCH-M15构建示意图Fig.1SchematicdiagramofOsMADS15genestructureandpCH-M15vectorA:OsMADS15基因结构及靶点位置。MADS:MADS-box结构域;AGG:前间区序列邻近基序(protospaceradjacentmotif,PAM);黑色线条为内含子。B:pCH-M15(pBin-sgR-Cas-OsCH-OsMADS15-T1)载体。两条直线位置即为靶序列插入位置。pOsU3:启动sgRNA转录的U3启动子;pOsUbi:水稻ubiquitin启动子,用以启动Cas9转录;NLS:核定位序列(nuclearlocalizationsequence);35S:启动抗性基因转录的烟草35S启动子;H+:潮霉素抗性基因;K+:卡那霉素抗性基因。
宋凡等:利用CRISPR-Cas9系统进行水稻OsMADS15基因的定向编辑973图2水稻转化植株的检测及突变型分析Fig.2DetectionoftransgenicriceplantsandmutationvariantsA:pBin-sgR-Cas-OsCH载体元件的PCR检测。M:Marker;1~4:载体元件存在的阳性植株;WT:元件不存在的野生型植株。B:9522Osmads15靶位点测序示意图及3种突变情况。AGG表示PAM;D1、D3、D5分别表示缺失1、3、5个碱基;Osmads15-3(反向)表示OsMADS15R引物反向测序结果,TTGAAGCAA表示该序列与原序列不同。C:OsMADS15蛋白的4个结构域(MADS、I、K、C)。灰色横虚线填充部分表示该段氨基酸序列与野生型不同;白色部分表示缺失。小穗心皮伸出内外稃变成幼苗状器官(图3-E),多层稃状结构取代了内轮的浆片、雄蕊和雌蕊器官(图3-F)。另外,虽然此株系中内稃结构也出现异常,但与已报道的dep突变体表型不同,我们未在此株系内发现内稃退化现象,相反,突变体内稃较外稃更长(图3-E)。9522Osmads15-3株系小穗异常生长表型与9522Osmads15-1株系类似,小穗由叶/稃状器官组成,且在基部有根状器官着生,但器官长度小于9522Osmads15-1株系(图3-G)。与9522Osmads15-1和9522Osmads15-3株系小穗表型不同,9522Osmads15-2株系小穗具有正常的内轮浆片、雄蕊和雌蕊器官(图3-H),但不育外稃和内稃器官同样更为细长;有趣的是,该株系中既有内稃较外稃变长的小穗(图3-H),也有内稃退化的小穗(图3-I),且在部分小穗内稃和不育外稃之间出现一个额外的稃状结构(图3-I)。OsMADS15基因转录水平分析显示,在突变体株系的内外稃组织中OsMADS15基因的转录水平显著下降(图3-J)。5突变植株9522Osmads15石蜡切片分析为了进一步观察分析突变植株异常稃状结构的细胞学属性,我们分别对3个株系进行了石蜡切片观察
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1 李一凡;多元质粒工程技术及CRISPR-Cas9介导的基因组编辑技术的建立与应用[D];天津大学;2015年
，本文编号：2560554
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