【摘要】：研究背景基因治疗是很有前景的生物疗法之一,在心血管、重症联合免疫缺陷(SCID-X1)、帕金森氏病、Wiskott-Aldrich综合征、癌症和神经系统变性疾病等领域中具有极为广阔的应用前景。非病毒载体具有免疫原性小、生产成本低和递送基因大小不受限制等优点,已成为基因治疗递送载体研发的热点。但其也存在内涵体逃逸及胞内携载基因释放困难,转染效率低等问题,因此,研究开发新型高效低毒的基因载体具有十分重要的意义。环糊精(Cyclodextrin)作为常用的医药用辅料,具有生物相容性好、易于功能化修饰等特性,因而具备成为优良基因递送载体的潜力。由于环糊精的引入可以降低其他基因载体的细胞毒性,使得其在基因载体系统的设计中受到极大的关注。环糊精衍生物可以直接作为基因递送载体,也可作为连接臂或是修饰物用于其他基因递送载体的构建,还可通过准聚轮烷或聚轮烷的形式用于基因递送。虽然环糊精在基因递送领域具有极为广阔的应用前景,但仍存在体循环稀释稳定性差、内涵体逃逸能力弱和转染效率低等亟待解决的问题。研究目的:本论文综合考虑以上研究背景,分别选用β-环糊精和α-环糊精为起始原料,设计合成两大类新型基因递送载体。第一类是以β-环糊精为起始原料,引入亲水的阳离子头部和疏水尾部形成两亲性聚阳离子β-环糊精衍生物。并通过引入不同类型及不同数目的阳离子头部,以期获得具有良好生物相容性,可以与质粒dna自聚集并形成稳定复合物和高转染效率的基因载体。第二类是以α-环糊精为起始原料,制备腙键封端的聚轮烷,再引入不同类型和不同数目的氨基基团形成具有酸敏特性的超分子聚轮烷基因载体,以期获得生物相容性好,具有内涵体酸敏刺激—响应特性和稀释稳定性的高效基因递送载体。实验方法:1、以β-cd为起始原料,与4-甲基苯磺酰氯发生酯化反应,得到6-位单取代的β-cd-ots。β-cd-ots与乙二胺进一步发生取代反应形成β-cd-eda。β-cd-eda与硬脂酸发生酰胺化反应,得到疏水尾部修饰的β-cd-eda-c18。通过控制反应当量,以羰基二咪唑桥联引入不同数目的n,n二甲基乙二胺(dmeda)或pei600作为亲水的氨基阳离子头部,分别得到两系列(dme系列和pei系列)6种两亲性聚阳离子β-环糊精衍生物。2、以α-cd为起始原料,与cooh-peg-cooh在水溶液中形成准聚轮烷。利用二苯甲酮腙在卡特缩合剂bop,hobt,edipa作用下对准聚轮烷进行封端反应得到聚轮烷;通过羰基二咪唑桥联并控制反应当量分别引入不同数目的dmeda或pei600作为阳离子头部,得到两系列(prdme系列和prpei系列)6种α-环糊精酸敏超分子聚轮烷。3、采用mtt实验对两类12种载体材料的细胞毒性进行评价;采用纳米粒度分析仪对载体材料/dna复合物的粒径和zeta电位进行表征;通过凝胶阻滞实验观察载体材料对质粒dna的复合能力;利用荧光显微镜以及流式细胞仪,以pegfp基因(cmv启动子调控的表达增强绿色荧光蛋白的质粒)为报告基因,以hek293t细胞为筛选模型,以基因转染的“黄金标准”pei25000作为阳性对照,对合成的12种载体材料转染活性进行了评价和筛选,并对优选的载体材料在血清存在下的转染活性进行了考察。4、利用纳米粒度分析仪和透射电子显微镜观察α-环糊精酸敏超分子聚轮烷prpei-2/dna复合物的酸敏特性;通过稀释稳定性实验、溶血实验对prpei-2/dna复合物的稀释稳定性和内涵体逃逸能力进行评价;选用不同细胞内吞途径抑制剂观测了prpei-2/dna复合物的入胞机制。结果与讨论:一、两亲性聚阳离子β-环糊精衍生物1、经核磁共振氢谱和红外图谱鉴定,所合成的两系列6种两亲性聚阳离子β-环糊精衍生物dme-1/2/3和pei-1/2/3均为目标产物。化合物dme-1,dme-2和dme-3中,每个β-环糊精分子上dmeda分子平均接枝度分别为3.0,7.1和10.3个;化合物pei-1,pei-2和pei-3中,每个β-环糊精分子上pei600分子平均接枝度分别为1.9,3.2和4.6个。2、mtt实验结果表明,连接有dmeda头部的dme系列衍生物均显示较低的细胞毒性,连接有pei600头部的pei系列衍生物在高浓度时具有一定的毒性,而且随着pei600接枝数目的增多,材料毒性增大,但其毒性仍低于pei25000。3、dme系列衍生物中,dme-2和dme-3与质粒dna形成的复合物粒径在1171~2828nm之间,而dme-1与质粒dna形成的复合物粒径在140~369nm之间。pei系列衍生物中,复合物的粒径均在97~181nm之间。zeta电位测定的结果显示,随着n/p比的增加,两系列衍生物与dna复合物的zeta电位均有所增加。4、凝胶阻滞实验显示,所有材料在重量比5:1时均可与质粒dna复合完全,dme-3和pei-3在n/p=1:1即与dna复合完全。5、基因转染活性测定结果显示,dme系列衍生物中,dme-2和dme-3的转染效率较差,与阴性对照裸dna相当。dme-1在n:p=30:1和50:1时具有较高的转染活性,虽然阳性转染细胞数不及阳性对照pei25000,但其平均荧光强度优于pei25000。而pei系列衍生物pei-1/2/3均具有较高的转染效率,其阳性转染细胞数和平均荧光强度均优于裸dna。虽然pei-2与pei-3的阳性转染细胞数不及pei25000,但其平均荧光强度在所有n/p比均优于pei25000。pei-1在n/p=30的情况下其阳性转染细胞数与阳性对照pei25000相当,pei-1的平均荧光强度在所有n/p比均优于pei25000。pei-1阳性转染细胞数和平均荧光强度均不受血清的影响,而阳性对照pei25000的阳性转染细胞数和平均荧光强度在血清存在条件下明显降低。pei-1/dna复合物入胞机制研究结果表明,pei-1与dna形成的复合物主要通过小窝蛋白介导的途径入胞。二、α-环糊精酸敏超分子聚轮烷1、经核磁共振氢谱和红外图谱鉴定,所合成的两系列6种α-环糊精酸敏超分子聚轮烷prdme-1/2/3和prpei-1/2/3均为目标物。prdme系列超分子聚轮烷prdme-1,prdme-2和prdme-3中,每个α-环糊精分子上dmeda分子平均接枝度分别为1.7,6.3和10.0个;prpei系列超分子聚轮烷prpei-1,prpei-2和prpei-3中,每个α-环糊精分子上pei600分子平均接枝度分别为1.1,2.9和4.1个。2、mtt实验结果显示,与pei25000相比,6种α-环糊精酸敏超分子聚轮烷均显示较低的细胞毒性。随着聚轮烷接枝的氨基阳离子数目增多,细胞毒性略有增加,但其毒性远低于pei25000。连接pei数目最多的聚轮烷prpei-3在高浓度100μg/ml时其细胞存活率为pei25000的1.6倍。3、prdme系列超分子聚轮烷中,prdme-1与质粒dna形成的复合物粒径在1973~3468nm之间,prdme-2与prdme-3与质粒dna形成的复合物粒径在92~232nm之间。而prpei系列的超分子聚轮烷prpei-1/2/3与质粒dna形成的复合物粒径在81~123nm之间。zeta电位测定结果显示,随着n/p比的增加两系列复合物的zeta电位均有所增加。4、凝胶阻滞实验结果显示,所得聚轮烷均具有极好的dna负载能力,除了prdme-1在重量比为10:1与dna复合完全,其余均在重量比1:1时与质粒dna复合完全。5、基因转染活性测定结果显示,带有dmeda氨基基团的聚轮烷prdme-1/2/3转染活性较差,与裸的质粒dna转染活性相当。而带有pei600基团的聚轮烷prpei-1/2/3均显示较高的转染活性,其阳性转染细胞数和平均荧光强度均优于裸dna。在聚轮烷prpei-1/2/3中,具有适中氨基密度的prpei-2转染活性最高,其阳性转染细胞数和平均荧光强度在相同n/p比的情况下均优于其他两种聚轮烷。虽然超分子聚轮烷prpei-1和prpei-3的阳性转染细胞数不及pei25000,但其平均荧光强度在重量比为30和50时与pei25000相当。超分子聚轮烷prpei-2的阳性转染细胞数与阳性对照pei25000相当,其平均荧光强度在重量比30和50时分别是pei25000的1.4和1.3倍。prpei-2的阳性转染细胞数和平均荧光强度均不受血清存在的影响,而阳性对照pei25000的阳性转染细胞数和平均荧光强度在血清存在条件下明显降低。6、prpei-2/dna复合物酸敏实验结果显示,ph7.4孵育时,透射电镜观测到prpei-2/dna复合物为规则的球形纳米粒,但在ph5.0孵育时,其粒径和形态都发生了显著的改变,粒径从158nm(ph7.4)变为555nm(ph5.0)且粒径分布出现了多重峰,复合物形态松散且不规则。上述结果表明prpei-2/dna复合物具有酸敏刺激响应特性,可以在血液循环和胞外环境中保持相对稳定(ph7.4),但在酸性的内涵体中(ph5.0)复合物结构变得松散膨大,使得聚轮烷与dna之间的相互作用减弱,从而有利于dna从复合物中释放。7、溶血实验结果显示,与ph7.4相比,超分子聚轮烷prpei-2/dna复合物在ph5.0时具有更强的膜破坏能力。进一步的扫描电子显微镜观察结果表明,当prpei-2/dna复合物与红细胞在ph7.4孵育时,红细胞形态完整,呈现双面微凹之圆盘状。当其与红细胞在ph5.0孵育时,红细胞的细胞膜上出现了孔洞,细胞溶胀甚至破裂。上述结果表明超分子聚轮烷prpei-2是一个很有前景的基因载体材料,其酸敏-刺激响应特性有利于基因载体复合物的内涵体逃逸,大大提高其基因转染效率。8、稀释稳定性实验结果显示,prpei-2可以与质粒dna形成粒径为160nm的纳米粒,而且其粒径及粒径分布可以在稀释至128倍时仍然保持稳定。相反地,pei25000/dna形成的复合物在稀释至16或32倍时,复合物纳米粒粒径变得不均一,出现解聚或形成团块,其粒径与稀释前相比分别增加了1.5或2倍,且粒径分布范围变宽,pdi增加到0.37。这些结果表明超分子聚轮烷prpei-2与质粒dna形成的复合物可以有效对抗进入体内后的血液稀释,具备优良基因治疗载体的特性。9、复合物入胞机制研究结果表明,当加入网格蛋白内吞抑制剂氯丙嗪的浓度为15,20和30μm时,与不加抑制剂的对照组相比,转染效率分别降低了45.7%,70.8%和99.4%;当加入小窝蛋白抑制剂金雀异黄酮浓度为75μm时,复合物转染效率与对照组相当,当浓度继续增大到150和200μm时,与不加抑制剂的对照组相比,转染效率分别降低了46.9%和49.7%;而当加入巨胞饮抑制剂阿米洛利浓度高达200μm时,prpei-2/dna复合物的转染效率依然保持不变。上述结果表明,prpei-2/dna复合物主要通过网格蛋白和小窝蛋白介导的内吞途径入胞,而网格蛋白介导的内吞机制对其转染效率影响更大。网格蛋白介导的内吞通常涉及网格蛋白的内化并将内吞物转移至内涵体和溶酶体降解,因此对于经网格蛋白内吞作用进入细胞的基因载体来说,提高其内涵体逃逸能力尤为重要。本文在超分子聚轮烷prpei-2中引入内涵体酸性环境下刺激响应的腙键,对提高prpei-2/dna的基因转染活性具有重要的意义。结论:1、设计并合成了两类12种基于环糊精的新型两亲性聚阳离子β-环糊精衍生物和α-环糊精酸敏超分子聚轮烷基因载体。核磁及红外鉴定结果表明所得载体材料与目标物结构一致。2、所构建的12种载体材料均具有较低的毒性,两类载体中α-环糊精酸敏超分子聚轮烷类具有更好的生物相容性。3、连接PEI600的载体材料其转染活性均优于连接DMEDA的载体材料,且氨基基团的数目会影响其转染效率。其中PEI-1和PRPEI-2在同类载体材料中转染活性最高,在含血清条件下依然能够保持良好的转染活性,且均优于PEI25000。4、PEI-1与DNA形成的复合物主要通过小窝蛋白介导的途径入胞,该途径可以避免被溶酶体降解,有利于提高该类基因递送系统的转染效率;PRPEI-2载体系统具有良好的稀释稳定性和酸敏刺激-响应特性,其主要入胞机制为网格蛋白介导的内吞,内吞后PRPEI-2可在胞内内涵体酸敏刺激下发生内涵体逃逸并能有效地释放所负载的DNA,有望作为刺激-响应的基因递送载体进行进一步的研究。
【图文】：
第四军医大学博士学位论文能与 PEG- -CDE/pDNA/CDs 准聚轮烷肌肉注射后在体液中逐级稀释有关。体液的稀释引起环糊精从 PEG 链上脱落，pDNA 释放。PEG- -CDE/p DNA 复合物内吞进入细胞后，通过树状聚合物的质子海绵效应和 -CD 分子与内涵体膜上脂质的相互作用而从内涵体逃逸[112]。
第四军医大学博士学位论文烷显示出很强的质粒 DNA 复合能力，凝聚成的纳米颗粒粒径在 100~400 nm 的范围内。所有阳离子聚轮烷/DNA 复合物都具有较高的基因转染效率。OEI 链长会影响聚轮烷的转染效率（随着 OEI 链长的增加），它们的转染效率与支链 PEI25000 接近，但细胞毒性明显低于支链 PEI25000，，这可能与超分子结构聚轮烷具有较低的正电荷密度有关。
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R450
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本文编号：
2561600
