菊花几丁质酶基因ChCHI的克隆及表达分析

发布时间：2019-11-23 10:52

【摘要】：根据GenBank发布的几丁质酶基因的保守序列设计简并引物,采用RT-PCR和RACE技术,克隆到菊花1个几丁质酶基因ChCHI(GenBank登录号为KX881373)。ChCHI基因cDNA全长为1 385 bp,包含960 bp开放阅读框,编码319个氨基酸。ChCHI属于亲水性蛋白,相对分子质量约为35.5 k D,等电点为6.38,为稳定蛋白,二级结构预测表明该蛋白以α螺旋和无规则卷曲为主。蛋白序列比对和进化树分析表明,ChCHI基因编码的蛋白属于糖苷水解酶19家族几丁质酶,与薇甘菊(ACO25187.1)几丁质酶蛋白的亲缘关系最近,序列一致性为87%。qRT-PCR分析结果显示,SA处理可以明显提高贡菊叶片中ChCHI的表达量。菊花ChCHI在对抗环境胁迫的分子调控中起重要作用。
【图文】：

物和0．1mmol·L－1SA处理叶片8h的cDNA进行菊花几丁质酶基因保守片段的PCＲ扩增，预期得到1条长度约为500bp的片段，该片段大小与预期目的条带一致，测序结果得到529bp的特异保守片段。根据该片段序列采用ＲACE技术，设计ＲACE引物，利用3’端引物GSP1和GSP2扩增出3’端目的片段，用5’端引物GSP3和GSP4扩增出5’端目的片段。将中间片段、3’端目的片段和5’端目的片段序列拼接，在开放阅读框(OＲF)区域设计引物，进行目的片段的扩增，得到了预期的片段，最终获得大小为1385bp的菊花几丁质酶基因的全长cDNA序列(图1)。其核苷酸序列在NCBI上Blast分析，发现其与薇甘菊的几丁质酶基因有较高一致性，为83%，将该基因命名为ChCHI，提交GenBank，，登录号为KX881373。包含1个19家族几丁质酶结构域，表明该片段为几丁质酶片段。经NCBI在线工具OＲFFinder软件查找，该基因具有960bp的完整开放阅读框，5’端非编码区为72bp，3’端非编码区为353bp，编码319个氨基酸(图2)。1．保守片段;2．5’－ＲACE;3．3’－ＲACE;4．开放阅读框片段;M．DL2000。1．Conservedregion;2．5’－ＲACE;3．3’－ＲACE;4．OＲF;M．DL2000．图1菊花几丁质酶基因的扩增Fig．1AmplificationofchitinasegeneinChrysanthemummorifolium

第2期崔波，等:菊花几丁质酶基因ChCHI的克隆及表达分析221ATG．起始密码子;TAA．终止密码子;阴影．保守序列ATG．Startcodon;TAA．Stopcodon;Shadow．ConservedSequence图2菊花几丁质酶基因核苷酸序列和推测的氨基酸序列Fig．2ThenucleotideacidsequenceanddeducedaminosequenceofchitinasegeneinChrysanthemummorifolium2．2菊花几丁质酶基因及编码蛋白序列的生物信息学分析利用NCBI的蛋白保守区数据库对菊花几丁质酶基因编码蛋白的保守区进行预测，结果表明(图3)，该蛋白在第64－301氨基酸残基之间有一个几丁质酶糖苷酶19家族结构域，在此结构域内有3个催化残基位点和7个糖结合位点，说明该结构域包含催化区;该结构域还是一个溶菌酶相似超家族基因的保守结构域，推测该蛋白兼具溶菌酶活性。将菊花的几丁质酶基因与其他植物的几丁质酶基因的氨基酸序列进行同源性比对(图4)，发现它们有较高的同源性。一致性分析表明，ChCHI的氨基酸序列与薇甘菊(MikaniamicranthaACO25187．1)、梅(PrunusmumeXP－008222679．1)和芝麻(SesamumindicumXP－011073914．1)的一

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