毛竹PheDof4-1基因克隆及表达分析
发布时间：2019-11-24 04:35
【摘要】：Dof(DNA binding with one finger)蛋白是植物特有的一类转录因子,由多基因共同编码,参与植物转录调控、生长发育及胁迫响应等生物学过程。以毛竹为研究对象,克隆了1个Dof基因,命名为Phe Dof4-1,基因长度为1 473 bp,推测其蛋白质产物的分子量是53.2 kDa,等电点为8.05。qRT PCR结果显示,Phe Dof4-1在低温和250 mmol·L~(-1) Na Cl处理的幼茎中诱导表达,而在20%PEG8000处理的根中表达则受到强烈抑制,在叶片中不同处理条件下呈现不同的表达趋势。研究结果为Phe Dof4-1在非生物胁迫中的作用提供理论依据,为竹子分子育种提供参考。
【图文】：
T-PCR），检测目的基因表达情况。TIP41基因作为内参基因[32]，引物见表1，每个反应设置3个生物学重复，生物技术和数据均使用RocheLightCycler480仪器进行分析，利用2-ΔΔCT法[33]分析3次生物学试验的数据，Excel进行作图。2结果与分析2.1PheDof4-1基因克隆以PheDof4-1-F和PheDof4-1-R为引物进行PCR扩增反应，PCR反应产物经0.8%的琼脂糖凝胶电泳，在1000～2000bp之间有一条清晰的亮带（见图1），连接pGEM-Teasy载体，进行测序（上海生工生物工程公司），序列长度为1473bp。M：Marker；1：PCR产物图1PheDof4-1基因PCR产物电泳图Figure1ElectrophoresisofPCRproductforPheDof4-1geneM:DL2000marker;lane1.PCRproducts2.2生物信息学分析PheDof4-1基因编码490个氨基酸，蛋白质的分子量为53.20kDa，等电点为8.06。氨基酸序列结构分析表明，PheDof4-1蛋白含有典型的完整的zf-dof结构，结构域位于105K到166S之间。PheDof4-1基因起始密码子上游约2.5kb序列进行顺势作用元件分析，发现含有TATA-box，CAAT-box等典型的真核生物顺势调控元件，还含有其他重要的作用元件，主要参与光响应、非生物胁迫和激素应答等相关调控。其中，光应答元件数量最多为11个，如G-Box、GAG-motif、AE-box、ATCT-motif和BoxII等调控元件，该基因还含有非生物胁迫响应的元件，如逆境响应元件TC-richrepeats，干旱诱导元件MBS，此外，还存在一些与赤霉素和水杨酸等激素相关元件如：GARE-motif、TATC-box和TCA-element等多种调控元件。对PheDof4-1基因组序列进行结构分析，结果显示其含有2个外显子和1个内含子，如图2所示。图2PheDof4-1基因结构分析Figure2GenestructureanalysisofPheDof4-1将PheDof4-1与水稻、小麦、玉米、高粱、大
44卷3期刘俊等:毛竹PheDof4-1基因克隆及表达分析401分支上的数字为1000次重复搜索的靴带值Numbersonbranchesindicatebootstrapestimatesfor1000replicates图3不同物种Dof蛋白进化树值Figure3PhylogenetictreeofDofproteinsindifferentspecies1～16分别代表不同样本的RNA1-16respectivelyrepresentdifferentsamplesofRNA图4毛竹RNA琼脂糖凝胶电泳Figure4TheelectrophoresisofRNAofmosobamboo图5PheDof4-1在干旱胁迫条件下的相对表达量Figure5TherelativeexpressionofPheDof4-1under20%PEG8000treatment2.5盐处理下PheDof4-1基因表达模式在盐胁迫处理下，PheDof4-1在不同组织中的表达模式如图6所示：在根中，PheDof4-1的表达呈现先下降后上升的趋势，在处理1h时表达量最低，仅为对照的0.17倍，随后逐渐升高，在处理24h时，表达量恢复正常，最后趋于稳定水平；在幼茎中，PheDof4-1的转录水平随着处理时间的延长，呈现增加的趋势，在处理12h时，表达量达到峰值，为对照组的2.2倍，随后表达逐渐降低；在叶片中，PheDof4-1基因的表达先升高后降低，处理1h时，表达量迅速升高，为对照组的2.4倍，随后逐渐下降，在处理12h，表达量降到最低值，仅为对照的3/10，，随后，表达量逐渐上升，恢复正常。PheDof4-1在不同组织中呈现不同的表达趋势，说明该基因在不同组织中呈现不同的表达水平。图6PheDof4-1在盐胁迫条件下的相对表达量Figure6TherelativeexpressionofPheDof4-1under250mmol·L-1Nacltreatment2.6冷处理下PheDof4-1基因表达模式在冷胁迫处理下，PheDof4-1基因受到诱导表达，结果如图7所示。在根中，PheDof4-1的表达
本文编号：2565276
【图文】：
T-PCR），检测目的基因表达情况。TIP41基因作为内参基因[32]，引物见表1，每个反应设置3个生物学重复，生物技术和数据均使用RocheLightCycler480仪器进行分析，利用2-ΔΔCT法[33]分析3次生物学试验的数据，Excel进行作图。2结果与分析2.1PheDof4-1基因克隆以PheDof4-1-F和PheDof4-1-R为引物进行PCR扩增反应，PCR反应产物经0.8%的琼脂糖凝胶电泳，在1000～2000bp之间有一条清晰的亮带（见图1），连接pGEM-Teasy载体，进行测序（上海生工生物工程公司），序列长度为1473bp。M：Marker；1：PCR产物图1PheDof4-1基因PCR产物电泳图Figure1ElectrophoresisofPCRproductforPheDof4-1geneM:DL2000marker;lane1.PCRproducts2.2生物信息学分析PheDof4-1基因编码490个氨基酸，蛋白质的分子量为53.20kDa，等电点为8.06。氨基酸序列结构分析表明，PheDof4-1蛋白含有典型的完整的zf-dof结构，结构域位于105K到166S之间。PheDof4-1基因起始密码子上游约2.5kb序列进行顺势作用元件分析，发现含有TATA-box，CAAT-box等典型的真核生物顺势调控元件，还含有其他重要的作用元件，主要参与光响应、非生物胁迫和激素应答等相关调控。其中，光应答元件数量最多为11个，如G-Box、GAG-motif、AE-box、ATCT-motif和BoxII等调控元件，该基因还含有非生物胁迫响应的元件，如逆境响应元件TC-richrepeats，干旱诱导元件MBS，此外，还存在一些与赤霉素和水杨酸等激素相关元件如：GARE-motif、TATC-box和TCA-element等多种调控元件。对PheDof4-1基因组序列进行结构分析，结果显示其含有2个外显子和1个内含子，如图2所示。图2PheDof4-1基因结构分析Figure2GenestructureanalysisofPheDof4-1将PheDof4-1与水稻、小麦、玉米、高粱、大
44卷3期刘俊等:毛竹PheDof4-1基因克隆及表达分析401分支上的数字为1000次重复搜索的靴带值Numbersonbranchesindicatebootstrapestimatesfor1000replicates图3不同物种Dof蛋白进化树值Figure3PhylogenetictreeofDofproteinsindifferentspecies1～16分别代表不同样本的RNA1-16respectivelyrepresentdifferentsamplesofRNA图4毛竹RNA琼脂糖凝胶电泳Figure4TheelectrophoresisofRNAofmosobamboo图5PheDof4-1在干旱胁迫条件下的相对表达量Figure5TherelativeexpressionofPheDof4-1under20%PEG8000treatment2.5盐处理下PheDof4-1基因表达模式在盐胁迫处理下，PheDof4-1在不同组织中的表达模式如图6所示：在根中，PheDof4-1的表达呈现先下降后上升的趋势，在处理1h时表达量最低，仅为对照的0.17倍，随后逐渐升高，在处理24h时，表达量恢复正常，最后趋于稳定水平；在幼茎中，PheDof4-1的转录水平随着处理时间的延长，呈现增加的趋势，在处理12h时，表达量达到峰值，为对照组的2.2倍，随后表达逐渐降低；在叶片中，PheDof4-1基因的表达先升高后降低，处理1h时，表达量迅速升高，为对照组的2.4倍，随后逐渐下降，在处理12h，表达量降到最低值，仅为对照的3/10，，随后，表达量逐渐上升，恢复正常。PheDof4-1在不同组织中呈现不同的表达趋势，说明该基因在不同组织中呈现不同的表达水平。图6PheDof4-1在盐胁迫条件下的相对表达量Figure6TherelativeexpressionofPheDof4-1under250mmol·L-1Nacltreatment2.6冷处理下PheDof4-1基因表达模式在冷胁迫处理下，PheDof4-1基因受到诱导表达，结果如图7所示。在根中，PheDof4-1的表达
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