陆地棉开花相关基因GhFLP5的表达及功能分析
发布时间：2019-11-26 00:03
【摘要】：【目的】克隆陆地棉开花促进因子家族的一个基因Flowering Promoting Factor1-like Protein 5(Gh FLP5),并对其时空表达模式进行研究,解析其在开花调控过程中的作用,为创制早熟陆地棉材料奠定基础。【方法】根据NCBI数据库中的序列,用Oligo7软件设计引物,以中棉所50(CCRI50)的c DNA为模板,克隆获得Gh FLP5。在Ex PASy网站上预测其蛋白的理化性质,同时在NCBI中检索其他物种中的FPF蛋白,使用Clustal X2进行多重序列比对,并用MEGA6构建系统进化树;取陆地棉早熟品种CCRI50和中晚熟品种鲁棉研28(Lu28)不同生长时期、不同组织的样品,对Gh FLP5的时间和空间表达模式进行分析;从基因组数据库中调取Gh FLP5起始密码子上游1 500 bp的片段,用Plant CARE在线工具预测其顺式作用元件,选取相关激素对二叶期棉花幼苗进行叶面喷施处理,研究Gh FLP5的应答反应;构建植物表达载体p BI121-Gh FLP5,转化拟南芥,观察转基因株系的表型,并用q RT-PCR对其内源基因表达的变化进行测定。【结果】Gh FLP5开放阅读框长300 bp,编码的蛋白质分子量为11.4 k D,共包含3个比较保守的区域,与大豆、苜蓿和毛果杨的开花促进因子亲缘关系较近。空间表达模式分析表明,Gh FLP5在叶片中优势表达,且在早熟品种CCRI50中的表达量显著高于晚熟品种Lu28;时间表达模式分析表明,在CCRI50中其表达量高峰出现在三叶期,而在Lu28中四叶期表达量最高。Gh FLP5的启动子上主要存在两大类顺式作用元件,一类是光响应元件和生物钟元件,一类是胁迫响应元件。根据顺式作用元件的分布和功能选取水杨酸(SA)、脱落酸(ABA)和茉莉酸(JA)喷施处理棉花幼苗,结果表明,Gh FLP5能响应外源SA和ABA而上调,也会被外施JA抑制。组成型表达Gh FLP5的拟南芥株系抽薹时间提前约9 d,开花时间提前约7 d,莲座叶数目减少,差异达到极显著水平。荧光定量的结果表明转基因拟南芥中促进开花的基因LEAFY(At LFY)、SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS(At SOC1)、FLOWERING LOCUS T(At FT)、APETALA1(At AP1)和FRUITFULL(At FUL)表达量显著升高,抑制开花的基因Flowering Locus C(At FLC)表达量显著降低。在转基因拟南芥中生长素应答基因SMALL AUXIN UPREGULATED 20(At SAUR20)和SMALL AUXIN UPREGULATED22(At SAUR22)显著上调,具有生物活性的赤霉素(GA)合成的相关基因GIBBERELLIN 20-OXIDASE 1(GA20OX1)的表达量提高2倍。【结论】转基因拟南芥早花表型明显,Gh FLP5可能在调控中发挥了双重作用,通过IAA和GA途径促进拟南芥的开花转型。
【图文】：
12期王聪聪等：陆地棉开花相关基因GhFLP5的表达及功能分析2227图5异源表达GhFLP5的拟南芥开花时间提前Fig.5TheArabidopsisheterelogous-expressingGhFLP5boltsandbloomsearlierthanthewildtype株系呈现明显的早花表型。转基因拟南芥在播种16d后开始抽薹，平均抽薹时间在17d左右，极显著地低于野生型的26d。35S::GhFLP5株系的开花时间在22d左右，而野生型的开花时间为29d，差异达到极显著水平，同时，其莲座叶数目也显著减少（表2）。为了深入研究异源表达GhFLP5促进拟南芥开花的分子机制，取生长18d的拟南芥的地上部分，提取RNA，检测拟南芥一些内源基因的表达。在组成型表达GhFLP5的转基因株系中，开花促进基因LEAFY（AtLFY）、SUPPRESSOROFOVEREXPRESSIONOFCONSTANS（AtSOC1）、FLOWERINGLOCUST（AtFT）、APETALA1（AtAP1）和FRUITFULL（AtFUL）的表达量都有所上调，尤其是AtAP1，表达量超过野生型中的16倍（图6-a）。而开花抑制因子FLOWERINGLOCUSC（AtFLC）的表达则被抑制（图6-a），这也与在拟南芥中组成型表达GhFLP5正调控开花时间的表型相符。同时，根据已有的报道对调控拟南芥开花时间的激素的生物合成酶的编码基因进行了检测，包括乙烯表2野生型和转基因拟南芥抽薹、开花时间及莲座叶数目统计Table2Boltingtime,floweringtimeandthenumberofrosetteleavesofwildandtransgenicplants材料Materials抽薹时间Boltingtime(d)开花时间Floweringtime(d)莲座叶数NumberofrosetteleavesWT26.05±1.3929.1±1.1710.31±0.73LR-617.95±0.95**21.85±0.67**7.22±0.56**LR-717.35±0.88**22.05±0.76**7.54±1.21**LR-917.5±1.32**21.8±1.06**7.39±0.87**LR-1019.1±1.25**22.55±0.99**7.98±0.32**
12期王聪聪等：陆地棉开花相关基因GhFLP5的表达及功能分析2227图5异源表达GhFLP5的拟南芥开花时间提前Fig.5TheArabidopsisheterelogous-expressingGhFLP5boltsandbloomsearlierthanthewildtype株系呈现明显的早花表型。转基因拟南芥在播种16d后开始抽薹，平均抽薹时间在17d左右，极显著地低于野生型的26d。35S::GhFLP5株系的开花时间在22d左右，而野生型的开花时间为29d，差异达到极显著水平，，同时，其莲座叶数目也显著减少（表2）。为了深入研究异源表达GhFLP5促进拟南芥开花的分子机制，取生长18d的拟南芥的地上部分，提取RNA，检测拟南芥一些内源基因的表达。在组成型表达GhFLP5的转基因株系中，开花促进基因LEAFY（AtLFY）、SUPPRESSOROFOVEREXPRESSIONOFCONSTANS（AtSOC1）、FLOWERINGLOCUST（AtFT）、APETALA1（AtAP1）和FRUITFULL（AtFUL）的表达量都有所上调，尤其是AtAP1，表达量超过野生型中的16倍（图6-a）。而开花抑制因子FLOWERINGLOCUSC（AtFLC）的表达则被抑制（图6-a），这也与在拟南芥中组成型表达GhFLP5正调控开花时间的表型相符。同时，根据已有的报道对调控拟南芥开花时间的激素的生物合成酶的编码基因进行了检测，包括乙烯表2野生型和转基因拟南芥抽薹、开花时间及莲座叶数目统计Table2Boltingtime,floweringtimeandthenumberofrosetteleavesofwildandtransgenicplants材料Materials抽薹时间Boltingtime(d)开花时间Floweringtime(d)莲座叶数NumberofrosetteleavesWT26.05±1.3929.1±1.1710.31±0.73LR-617.95±0.95**21.85±0.67**7.22±0.56**LR-717.35±0.88**22.05±0.76**7.54±1.21**LR-917.5±1.32**21.8±1.06**7.39±0.87**LR-1019.1±1.25**22.55±0.99**7.98±0.32**
本文编号：2565917
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12期王聪聪等：陆地棉开花相关基因GhFLP5的表达及功能分析2227图5异源表达GhFLP5的拟南芥开花时间提前Fig.5TheArabidopsisheterelogous-expressingGhFLP5boltsandbloomsearlierthanthewildtype株系呈现明显的早花表型。转基因拟南芥在播种16d后开始抽薹，平均抽薹时间在17d左右，极显著地低于野生型的26d。35S::GhFLP5株系的开花时间在22d左右，而野生型的开花时间为29d，差异达到极显著水平，同时，其莲座叶数目也显著减少（表2）。为了深入研究异源表达GhFLP5促进拟南芥开花的分子机制，取生长18d的拟南芥的地上部分，提取RNA，检测拟南芥一些内源基因的表达。在组成型表达GhFLP5的转基因株系中，开花促进基因LEAFY（AtLFY）、SUPPRESSOROFOVEREXPRESSIONOFCONSTANS（AtSOC1）、FLOWERINGLOCUST（AtFT）、APETALA1（AtAP1）和FRUITFULL（AtFUL）的表达量都有所上调，尤其是AtAP1，表达量超过野生型中的16倍（图6-a）。而开花抑制因子FLOWERINGLOCUSC（AtFLC）的表达则被抑制（图6-a），这也与在拟南芥中组成型表达GhFLP5正调控开花时间的表型相符。同时，根据已有的报道对调控拟南芥开花时间的激素的生物合成酶的编码基因进行了检测，包括乙烯表2野生型和转基因拟南芥抽薹、开花时间及莲座叶数目统计Table2Boltingtime,floweringtimeandthenumberofrosetteleavesofwildandtransgenicplants材料Materials抽薹时间Boltingtime(d)开花时间Floweringtime(d)莲座叶数NumberofrosetteleavesWT26.05±1.3929.1±1.1710.31±0.73LR-617.95±0.95**21.85±0.67**7.22±0.56**LR-717.35±0.88**22.05±0.76**7.54±1.21**LR-917.5±1.32**21.8±1.06**7.39±0.87**LR-1019.1±1.25**22.55±0.99**7.98±0.32**
12期王聪聪等：陆地棉开花相关基因GhFLP5的表达及功能分析2227图5异源表达GhFLP5的拟南芥开花时间提前Fig.5TheArabidopsisheterelogous-expressingGhFLP5boltsandbloomsearlierthanthewildtype株系呈现明显的早花表型。转基因拟南芥在播种16d后开始抽薹，平均抽薹时间在17d左右，极显著地低于野生型的26d。35S::GhFLP5株系的开花时间在22d左右，而野生型的开花时间为29d，差异达到极显著水平，，同时，其莲座叶数目也显著减少（表2）。为了深入研究异源表达GhFLP5促进拟南芥开花的分子机制，取生长18d的拟南芥的地上部分，提取RNA，检测拟南芥一些内源基因的表达。在组成型表达GhFLP5的转基因株系中，开花促进基因LEAFY（AtLFY）、SUPPRESSOROFOVEREXPRESSIONOFCONSTANS（AtSOC1）、FLOWERINGLOCUST（AtFT）、APETALA1（AtAP1）和FRUITFULL（AtFUL）的表达量都有所上调，尤其是AtAP1，表达量超过野生型中的16倍（图6-a）。而开花抑制因子FLOWERINGLOCUSC（AtFLC）的表达则被抑制（图6-a），这也与在拟南芥中组成型表达GhFLP5正调控开花时间的表型相符。同时，根据已有的报道对调控拟南芥开花时间的激素的生物合成酶的编码基因进行了检测，包括乙烯表2野生型和转基因拟南芥抽薹、开花时间及莲座叶数目统计Table2Boltingtime,floweringtimeandthenumberofrosetteleavesofwildandtransgenicplants材料Materials抽薹时间Boltingtime(d)开花时间Floweringtime(d)莲座叶数NumberofrosetteleavesWT26.05±1.3929.1±1.1710.31±0.73LR-617.95±0.95**21.85±0.67**7.22±0.56**LR-717.35±0.88**22.05±0.76**7.54±1.21**LR-917.5±1.32**21.8±1.06**7.39±0.87**LR-1019.1±1.25**22.55±0.99**7.98±0.32**
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