β-NGF基因克隆和诱导表达及其对角膜缘干细胞的作用

发布时间：2019-11-26 09:57

【摘要】：目的:构建含有神经生长因子(β-NGF)慢病毒表达载体p LVX-TRE3G-IRES-β-NGF,使用Tet-on 3G四环素诱导表达系统,研究不同剂量强力霉素(Dox)诱导β-NGF基因表达对体外培养角膜缘干细胞(LSCs)增殖的影响。方法:1、从SD大鼠脑组织提取总RNA,逆转录成c DNA,利用分子生物学技术,克隆鼠的β-NGF基因完整编码区,将β-NGF基因定向插入载体p LVX-TRE3G-IRES中。2、将重组载体p LVX-TRE3G-IRES-β-NGF和载体p LVX-Tet3G分别转染HEK293FT细胞,制备收获慢病毒;共感染空白HEK293FT细胞,同时用不同剂量强力霉素(Dox)诱导NGF表达(分为未转染组、0、100、500和1000ng/ml Dox诱导表达组)。48h后,收集细胞,western-blot检测各组细胞内β-NGF表达情况。同时收集培养上清,(1)Elisa检测各组上清内β-NGF的分泌量;(2)制作条件培养基,加入PC-12细胞培养基中进行诱导培养,观察PC-12细胞诱导分化情况。3、体外培养LSCs,慢病毒共感染LSCs,分为对照组(未转染组)和诱导表达组[实验组A(p LVX-TRE3G-IRES-β-NGF和p LVX-Tet3G共感染,Dox 1000ng/ml)、实验组B(p LVX-TRE3G-IRES-β-NGF和p LVX-Tet3G共感染,Dox 100ng/ml)、实验组C(p LVX-TRE3G-IRES和p LVX-Tet3G共感染,Dox1000ng/ml)]进行培养,分别选取各组诱导表达48h后的细胞,细胞免疫荧光染色检测NGF、p63、Trk A、p38表达。4、相关数据作统计学分析。结果:1.双酶切和测序鉴定重组质粒p LVX-TRE3G-IRES-β-NGF序列和方向正确。2、β-NGF在转染细胞内被诱导表达,随着Dox剂量增加,表达量增强;β-NGF在细胞培养基的上清内表达,表达量随Dox剂量增加而增多。3、诱导表达的条件培养基可诱导PC-12细胞形态改变,表达神经元特异性烯醇化酶(NSE)蛋白。4、NGF在LSCs内被诱导表达,随着Dox剂量增加,NGF表达量增强;各实验组p63、Trk A随着NGF的表达量增加而降低,p38表达量的随着NGF的表达量增加而增加。结论:1、成功重组慢病毒载体p LVX-TRE3G-IRES-β-NGF,转染后β-NGF基因能够在HEK293FT细胞中表达和分泌,且该蛋白具有诱导PC-12细胞向神经元样细胞分化的能力。2、运用Tet-On 3G四环素诱导表达系统,可成功在LSCs获得不同剂量NGF蛋白表达,低剂量诱导组诱导表达NGF能够保持LSCs干细胞特性且对其具有促进增殖的作用。
【图文】：

.1.5 主要实验试剂的配制.1.5.1细胞培养液配制：PC-12细胞未分化培养基：15%马血清，5%胎牛血清（FBS），1%1640培养基至100ml，4℃保存备用；PC-12细胞分化培养基：15%马血清，1%PS，加1640培养基至100m备用；HEK293FT细胞：10%胎牛血清（FBS），1%PS，加H-DMEM至10存备用；LSCs：20%胎牛血清（FBS），1%PS，加F12培养基至100ml，4℃保冻存液：90%胎牛血清（FBS），10%DMSO混合均匀，现配现用.1.5.2 药物配制：诱导剂强力霉素（Dox）：称取10mg Dox加入100ml 3dH2O，0.22图1．四环素诱导表达系统载体图谱Fig.1 Tet-Express System vector map

剧烈振荡15s，，静置5min，新的Epp管中，重复上一步的操作；的Epp管中加入已预冷的异丙醇0.中取出，12000g/min，离心10min（%乙醇（0.25ml的DEPC水+0.75ml的in，离心5分钟（4℃），弃上清；加入10μl DEPC水溶解RNA，55℃放其纯度及浓度；1μl的6×上样缓冲液混匀，配1.5%电泳20分钟。取电泳产物见三条带
【学位授予单位】：贵州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R772.2

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本文编号：2566105