从江香猪FoxO 4基因真核表达载体的构建及其在皮下脂肪前体细胞中的表达

发布时间：2019-11-26 21:35

【摘要】：本研究旨在克隆从江香猪FoxO 4基因编码区序列,对FoxO 4基因功能进行初步探究。采用qRT-PCR技术对从江香猪(6月龄)不同组织中FoxO 4基因的相对表达量进行检测;PCR扩增FoxO 4基因CDS区,构建真核表达载体pEGFP-N3-FoxO 4;利用脂质体法将重组质粒pEGFP-N3-FoxO 4瞬时转染从江香猪皮下脂肪前体细胞,通过qRT-PCR方法,检测FoxO 4、PPARγ、LPL、FAS、ACC、ATGL、HSL的表达水平。结果显示:FoxO 4基因在从江香猪脂肪组织中表达量最高;构建的重组真核表达载体pEGFP-N3-FoxO 4在从江香猪皮下脂肪前体细胞中成功表达,与对照组相比,LPL、FAS、ACC、ATGL、HSL基因的表达均显著上调。综上表明,FoxO 4对脂质代谢具有一定的调控作用,可能是影响从江香猪猪肉品质的重要候选基因,为进一步了解从江香猪脂肪沉积机制提供理论基础。
【图文】：

ｏｂｖｉｏｕｓｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｉｓｉｎｄｉｃａｔｅｄｂｙｔｈｅｓａｍｅｌｅｔｔｅｒ（Ｐ＞０．０５）图１ＦｏｘＯ４基因ｍＲＮＡ在从江香猪不同组织中的相对表达Ｆｉｇ．１ＴｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｌｅｖｅｌｏｆＦｏｘＯ４ｇｅｎｅｉｎｄｉｆｆｅｒ－ｅｎｔｔｉｓｓｕｅｓｏｆＣｏｎｇｊｉａｎｇＸｉａｎｇｐｉｇＭ．ＤＬ５０００ｍａｒｋｅｒ；１～３．扩增的ＦｏｘＯ４Ｍ．ＤＬ５０００ｍａｒｋｅｒ；１－３．ＴｈｅＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＦｏｘＯ４图２ＦｏｘＯ４基因的ＰＣＲ扩增Ｆｉｇ．２ＴｈｅＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＦｏｘＯ４ｇｅｎｅＭ．ＤＬ５０００ｍａｒｋｅｒ；１～４．扩增的ＦｏｘＯ４产物Ｍ．ＤＬ５０００ｍａｒｋｅｒ；１－４．ＴｈｅＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＦｏｘＯ４图３ＦｏｘＯ４基因的菌液ＰＣＲ扩增Ｆｉｇ．３ＴｈｅｂａｃｔｅｒｉａｌＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＦｏｘＯ４ｇｅｎｅ条带：大小约为４７００ｂｐ的ｐＥＧＦＰ－Ｎ３载体片段和１５３９ｂｐ的目的基因ＦｏｘＯ４片段。结果表明，ｐＥＧＦＰ－Ｎ３－ＦｏｘＯ４重组质粒构建成功（图４）。２．５真核表达载体ｐＥＧＦＰ－Ｎ３－ＦｏｘＯ４的测序鉴定通过测序进一步验证，将测序结果与ＮＣＢＩ中Ｍ．ＤＬ１５０００ｍａｒｋｅｒ；１、２．重组质粒ｐＥＧＦＰ－Ｎ３－ＦｏｘＯ４的双酶切Ｍ．ＤＬ１５０００ｍａｒｋｅｒ；１，２．ＤｏｕｂｌｅｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｐＥＧＦＰ－Ｎ３－ＦｏｘＯ４图４ｐＥＧＦＰ－

Ｃ．１０ｄ图５皮下脂肪前体细胞的原代、传代培养（１００×）Ｆｉｇ．５Ｐｒｉｍａｒｙｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅｏｆｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅ（１００×）Ａ．诱导培养２４ｈ（１００×）；Ｂ．诱导培养１４４ｈ（１００×）；Ｃ．油红Ｏ染色（２００×）Ａ．Ｉｎｄｕｃｅｄｃｕｌｔｕｒｅ２４ｈ（１００×）；Ｂ．Ｉｎｄｕｃｅｄｃｕｌｔｕｒｅ１４４ｈ（１００×）；Ｃ．ＯｉｌｒｅｄＯｓｔａｉｎｉｎｇ（２００×）图６皮下脂肪前体细胞的诱导分化及鉴定Ｆｉｇ．６ＩｎｄｕｃｅｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉｔａｔｉｏｎａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅＡ．空白对照；Ｂ．阴性对照；Ｃ．重组质粒ｐＥＧＦＰ－Ｎ３－ＦｏｘＯ４Ａ．Ｂｌａｎｋｃｏｎｔｒｏｌ；Ｂ．Ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ；Ｃ．ＴｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｏｆｐＥＧＦＰ－Ｎ３－ＦｏｘＯ４图７皮下脂肪前体细胞的转染（１００×）Ｆｉｇ．７Ｔｈｅｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｏｆｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅ（１００×）ＡＴＧＬ基因的表达水平上调，极显著高于阴性对照组（Ｐ＜０．０１）；ＨＳＬ的表达水平也上调，显著高于阴性对照组（Ｐ＜０．０５），，ＰＰＡＲγ的表达水平在转染前后差异不显著（Ｐ＞０．０５）（图８）。３讨论本研究采用ｑＲＴ－ＰＣＲ方法对ＦｏｘＯ４基因在从江香猪心、肝、脾、肺、肾、大肠、小肠、背最长饥脂２２７３

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本文编号：2566308