香樟MK基因的克隆与生物信息学分析

发布时间：2019-11-27 10:08

【摘要】：本研究基于香樟转录组测序数据,设计特异性引物进行扩增,应用反转录RT-PCR技术,克隆获得香樟合成甲羟戊酸激酶(Mevalonate kinase,MK)的开放读码框ORF序列全长。根据Gibison同源重组的方法将目的基因克隆至pSMART-LCKan载体上,将鉴定为阳性的重组质粒进行测序分析以及生物信息学分析。测序结果表明:CcMK基因ORF全长为1 194 bp,编码397个氨基酸。理化分析可知CcMK蛋白分子式为C_(1852)H_(3027)N_(487)O_(574)S_(17),相对分子质量为41 845.34,等电点为5.30。CcMK蛋白是一个定位于细胞质,不含信号肽的亲水性稳定蛋白,且含有保守结构域GHMP激酶家族特异性的N末端和C末端。分子进化树分析结果表明,香樟CcMK蛋白与红掌、川贝母、野芭蕉、海枣、油棕等植物的蛋白处于同一分支上,亲缘关系较近。利用实时荧光定量PCR方法检测CcMK基因在香樟的叶、茎和根中的表达情况,结果表明,CcMK基因在香樟的叶中表达丰度最高。本研究首次从香樟中克隆了CcMK基因,并对其进行了生物信息学分析,为进一步研究CcMK基因在香樟萜类合成途径中的作用奠定了理论基础。
【图文】：

热带作物学报第38卷图1PCR扩增CcMK基因Fig.1PCRamplificationofCcMKgeneM：5000bpDNAMarker；1、2：CcMK基因扩增产物。M:5000bpDNAMarker;1,2:PCRproductofCcMKgene.5000300020001000bpM12位的表达情况，利用实时荧光定量PCR的方法检测CcMK基因在香樟叶、茎、根中的表达量，采用BIO-RADCFX96实时PCR检测系统。使用的引物序列为：CcMK-F：5′-TGAGCGAGCATCCAGGCATC-3′；CcMK-R：5′-TGAAGCAGGCGACTGGATAATG-3′。实时PCR检测的反应体系参照iQSYBRGreenSuperMix（BIO-RAD）体系，每个反应体系重复3次。PCR程序如下：95℃预变性3min，95℃变性10s，58℃退火15s，72℃延伸20s，共45个循环DissociationStage。实时PCR反应以香樟肌动蛋白基因CcACT（KM086739.1）为内参，内参引物序列为：ACTIN1-F：5′-GAGCTACCTGATGGGCAAGTG-3′；ACTIN1-R：5′-AGAACCACCACTAAGCACGATG-3′。组织表达以叶中的表达量为对照。2结果与分析2.1CcMK的基因克隆以香樟的cDNA为模板，PCR扩增得到1200bp左右的片段，电泳结果如图1所示。显示目的条带与预期大小相符，将其克隆至pSMART-LCKan载体上，经过阳性克隆筛选，送至上海生工生物公司测序，大小为1194bp，编码397个氨基酸（图2）。图2CcMK基因编码区DNA序列及氨基酸序列Fig.2CodingsequenceandaminoacidsequenceofCcMKgenecDNA-2304-

Ｍü烱OSUI在线分析CcMK，结果表明，CcMK蛋白不含信号肽，疏水性平均值为0.290428，疏水性和亲水性氨基酸分布均匀，结合跨膜结构域的预测结果，说明CcMK蛋白为水溶性蛋白。2.4CcMK蛋白的结构域分析经SMART工具分析，CcMK蛋白中含有两个保守结构域，即GHMP激酶家族特异的N末端和C末端的保守结构域GHMP激酶的功能域。氨基酸序列的132~213位是GHMP激酶N端区域。285~365位是GHMP激酶C端的结构域。经BlastP预测CcMK编码蛋白具有1-383个氨基酸之间的MevalonateKinase的功能域（图5），表明其具有甲羟戊酸激酶的功能。图5CcMK蛋白保守功能域Fig.5ConserveddomainsofCcMKprotein0100200300397132位-213位GHMP激酶N末端285位-365位GHMP激酶C末端2.5CcMK蛋白的信号肽、亚细胞定位和跨膜结构分析经SignalP4.1server预测，CcMK蛋白不含信号肽，为非分泌蛋白（图6）。经TargetP1.1server在线软件进行亚细胞定位预测表明，氨基酸序列中含有叶绿体转运肽的可能性为0.016，含有线粒体转运肽的可能性为0.128，，含有信号肽可能性为0.279，其它可能性为0.541，可靠等级为4，显示CcMK可能定位于细胞质。利用TMHMM软件预测CcMK蛋白不含跨膜结构域，整条多肽链均处于细胞膜外，因此推测CcMK蛋白是不通过蛋白转运，直接在细胞质基质0102030405060701.00.80.60.40.20.0ScoreC-scoreS-scoreY-scoreSignalP-4.1prediction(euknetworks):SequencePosition图6CcMK蛋白信号肽预测分析（SignalP预测）Fig.6PredictionofsignalpeptideofCcMKprotein(SignalPprediction)曹先爽等：香樟MK基因的克隆与生物信息学分析-2307-

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