七鳃鳗分化簇CD63的基因克

发布时间：2019-12-05 01:20

【摘要】：七鳃鳗属于无颌类脊椎动物,处于向有颌类进化的节点。它们不仅有先天免疫系统,还有一套不同于有颌类脊椎动物的适应性免疫系统。因此,其进化地位和免疫系统显得尤为独特。本文首次从七鳃鳗体内克隆到了其分化簇基因CD63,并利用生物信息学和实时定量PCR以及功能片段的重组表达、Western blot、真核转染等方法对其进行了初步的分析,为探讨CD63在七鳃鳗的免疫应答中的作用提供了一定的理论依据。CD63参与众多的生物学过程,比如免疫过程、细胞迁移过程和癌症的发展等。目前的研究多集中于哺乳动物和细胞方面。本文首次从古老的无颌类动物——七鳃鳗中克隆获得了CD63基因(LjCD63),并成功表达了其功能片段(Extracellular loop 2,EC2)。LjCD63的ORF区有738bp,编码245个氨基酸,其理论分子量约为26.48kDa,理论等电点为6.79,该区并无信号肽,但是具有四次跨膜结构域,为疏水性蛋白质。该蛋白可能存在N型糖基化和棕榈酰化现象。在功能区域EC2中,有Q(X)4GCC(X)5DW模式(X为任意氨基酸)、VPDSCC短肽;在C末端则有G(S/E)YE(Q)V(T)M(V)。这些较为保守的模块可能对LjCD63的功能有重要作用。qPCR结果显示,LPS刺激后,LjCD63在肝脏中出现显著上调,暗示CD63可能与肝脏内的免疫过程有关。Lj CD63 ORF区的重组蛋白(recombinant LjCD63,rLjCD63)在传统的原核表达系统中难于表达,其功能片段EC2区的重组蛋白(rLjCD63 EC2)则易于表达,其最优的表达条件为:IPTG浓度为0.5mM,诱导温度为20℃。Western blot结果说明,抗人CD63 EC2区的多克隆抗体(anti-human CD63 EC2 polyclonal antibody,anti-hCD63)可以与日本七鳃鳗CD63 EC2区的重组蛋白相互结合。但是,免疫组织化学的初步结果显示,制备特异性较高的七鳃鳗CD63 EC2区的抗体是必要的。利用以绿色荧光蛋白GFP为标记的LjCD63真核转染结果表明,LjCD63主要定位在细胞膜上及细胞内部的某些特定的结构中,提示LjCD63可能在膜结构上与来自细胞外部或细胞内环境的分子发生相互作用进而影响细胞的功能。在七鳃鳗体内,LjCD63的具体作用机制还有待进一步阐明。
【图文】：

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辽宁师范大学硕士学位论文高的 GC 含量，即所谓的“GpC 岛”。5’端的-123~-130 处有转录因子位点[22]，这个位点可能在启动其转录方面比较关键。相对分子量为 25,475D，是 Tetraspanins 超家族成员之一。经软件分和空间三维结构如图 1.1 所示。其中，，A 图中的数字表示氨基酸个可以看出，CD63 是一种具有 4 个α螺旋的四次跨膜蛋白。

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辽宁师范大学硕士学位论文.1 A 是从日本七鳃鳗的心脏中提取的 RNA，然后用 2%的琼脂糖凝胶电泳结果显示，所提RNA的 28S、18S 非常清晰。利用紫外分光光度计测得的 OD20 左右。说明 RNA 样品未出现降解且纯度也达到了下一步实验的要求。jCD63 序列扩增及鉴定转录后的心脏cDNA为模板, LjCD63 Forward及LjCD63 Reverse引物进行，得到 LjCD63 ORF 区 DNA 片段 (图 2.1 B)。将图 2.2 中的目的片段切胶回MD18 T 载体后，转化至 E. coli JM109 菌体中，挑选单菌落过夜培养，以模板，用 LjCD63 上下游引物做质粒 PCR 鉴定 (图 2.1 C)，并将质粒送上NA 测序，对测序结果分析，得到准确的 LjCD63 ORF 区, 序列如图 2.2 所信息提交到 NCBI 数据库 (KT225459)。
【学位授予单位】：辽宁师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：Q78

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