禾谷缢管蚜RSC1阳离子通道基因和钠离子通道辅助亚基基因初步研究

发布时间：2020-02-03 11:59

【摘要】：禾谷缢管蚜Rhopalosiphum padi(L.)是重要的麦类作物害虫,其广泛分布于世界各地,能刺吸危害小麦叶片,传播大麦黄矮病毒(Barley yellow dwarf virus,BYDV),给小麦生产造成重大经济损失。拟除虫菊酯是一类重要的杀虫剂,由于其杀虫活性高,并对哺乳动物低毒,被广泛用于防治农业害虫。由于长期大量的使用,许多害虫对拟除虫菊酯类杀虫剂产生了抗药性。面对日益增长的害虫抗性问题,迫切需要研发作用于新靶标位点的化学杀虫剂。本研究克隆得到禾谷缢管蚜阳离子通道RSC1基因和钠离子通道辅助亚基基因,并进行了生物信息学及表达模式分析,研究结果能够为开发作用于新靶标的杀虫剂奠定基础,且对于害虫抗药性治理具有重要的意义。1、禾谷缢管蚜阳离子通道基因RSC1克隆及其生物信息学分析采用RT-PCR技术,克隆获得了禾谷缢管蚜阳离子通道基因RSC1完整的开放阅读框,其GenBank登录号为KU640190,核苷酸长度6687 bp,编码2228个氨基酸。在NCBI上Blastp分析发现,该基因编码的氨基酸序列与豌豆蚜Acyrthosiphon pisum对应基因编码的氨基酸序列一致性最高,达到90%以上。利用TMHM-M-2.0软件对RSC1的跨膜结构分析结果表明,禾谷缢管蚜RSC1具有SC1通道的典型结构特征,其整个蛋白序列包括4个同源结构域,每个结构域有6个跨膜区。通过与其他9种昆虫(炓腹果蝇Drosophila melanogaster,德国小蠊Blattella germanica,赤拟谷盗Tribolium castaneum,西方蜜蜂Apis mellifera,印度跳蚁Harpegnathos saltator,熊蜂Bombus terrestris,佛罗里达弓背蚁Camponotus floridanus,豌豆蚜及切叶蚁Acromyrmex echinatior)的序列对比发现,RSC1和其他同源通道蛋白在其四个结构域的成孔区均有一个特殊的DEEA模体(motif)。系统进化分析结果显示,RSC1基因与电压门控钠离子通道组成一个进化枝,电压门控钙离子通道为另外一个进化枝,SC1与电压门控钠离子通道在进化上有更近的起源关系。并且SC1类阳离子通道只存在于节肢动物中,脊椎动物尚未发现该类基因,该通道可能作为开发新型杀虫剂的神经靶标。2、禾谷缢管蚜RSC1基因在高效氯氟氰菊酯诱导下表达特性分析LC15(0.1484 mg/L)、LC35(0.3244 mg/L)两个亚致死浓度和致死中浓度LC_(50)(0.5153mg/L)的高效氯氟氰菊酯处理禾谷缢管蚜成蚜后,qPCR结果表明,用药剂处理6 h后,处理组RSC1基因表达量显著低于对照组,分别为对照的0.57,0.82和0.78倍;药剂处理24h后,RSC1基因表达量相对于对照处理为上调趋势,表达量分别为对照的2.19,1.33和1.19倍,其中LC15处理组表达量显著高于对照组,LC_(50)和LC35处理组的表达量与对照组表达量差异不显著;因此,SC1通道在昆虫中可能对维持神经突触的持续传导和调节昆虫神经系统的稳定性有着重要的作用。3、禾谷缢管蚜钠离子通道辅助亚基克隆及其生物信息学分析RT-PCR克隆获得禾谷缢管蚜钠离子通道辅助亚基TipE及其同源亚基TEH1、TEH2、TEH3、TEH4基因。五个基因的开放阅读框长度依次分别为1380、951、999、1422、1542bp,分别编码459、299、332、473和513个氨基酸。禾谷缢管蚜与炓腹果蝇的辅助亚基的氨基酸序列相似性较低,而与豌豆蚜的辅助亚基的氨基酸序列一致性最高,达到80%以上。采用Kyte and Doolittle软件分析禾谷缢管蚜RpTipE氨基酸残基的疏水性结构发现其包含有两个跨膜区,该拓扑结构与哺乳动物β亚基(Slo-β)相似。构建禾谷缢管蚜与豌豆蚜钠离子通道辅助亚基系统发育树显示,两种昆虫的TipE亚基与其同源亚基TEH1-4分别各占一枝,同源亚基TEH1和TEH2,TEH3和TEH4之间亲缘关系比较相近。此外,建立昆虫钠离子通道辅助亚基与脊椎动物钠离子通道辅助亚基系统进化树显示,该发育树分为两大支,包括脊椎动物钠离子通道辅助亚基β亚基和昆虫钠离子通道辅助亚基在系统进化树分为两大支。因此,昆虫钠离子通道辅助亚基可能成为一个潜在的新化学靶标。4、禾谷缢管蚜钠离子通道辅助亚基表达模式分析实时荧光定量PCR结果表明,钠离子通道辅助亚基TipE及其同源亚基TEH1-4在禾谷缢管蚜整个发育历期均有表达,但5个基因在其不同发育时期表达的变化规律不同。此外,本研究检测并分析了禾谷缢管蚜在高效氯氟氰菊酯亚致死浓度LC_(25)(0.2544 mg/L)和致死中浓度LC_(50)(0.5153 mg/L)处理后12 h和24 h,TipE-like共5个基因的相对表达量变化。研究结果表明,12 h后LC_(25)处理组,TipE,TEH1,TEH2,TEH3和TEH4基因表达量为下调趋势,表达量分别为对照的0.59、0.28、0.28、0.27和0.26倍;处理组表达量显著低于清水对照组。LC_(50)处理后12 h,表达量分别为对照的0.41、0.32、0.22、0.41和0.30倍;处理组表达量显著低于清水对照组。处理后24 h,5个基因表达量为下调趋势。LC_(25)亚致死浓度处理后24h,表达量分别为对照的0.55、0.44、0.34、0.13和0.42倍;处理组表达量显著低于清水对照组。LC_(50)处理后24h后,表达量分别为对照的0.49、0.33、0.31、0.12和0.38倍;处理组表达量显著低于清水对照组;施药后24h,LC_(25)和LC_(50)两组施药处理组表达量差异不显著。因此,昆虫钠离子通道辅助亚基在调节其钠离子通道的门控性质可能起到重要的作用。
【图文】：

钠离子通道,电压门控,哺乳动物

图 1-1 哺乳动物电压门控钠离子通道结构（Catterall et al. 2005）Fig. 1-1 The structure of voltage-gated sodium channel of mammal（Catterall et al. 2005）1.3.2 昆虫钠离子通道的结构和功能昆虫只有一个编码钠离子通道α亚基的基因（Loughney et al. 1989；Dong 2010）。尽管只有一个单基因，但昆虫转录时存在广泛的选择性剪切和 RNA 编辑，从而产生许多功能和药理独特的钠离子通道变体（Dong 2007 2010）。然而，通过分析黑腹果蝇基因组，，发现其缺乏哺乳动物钠离子通道β亚基的直系同源蛋白质（Littleton & Ganetzky2000）。学者发现，黑腹果蝇的 para 基因可以编码大量具有重要生理功能的钠离子通道α亚基（Loughneyet al. 1989）。然而，将 para 基因的 cRNA 注射到非洲爪蟾卵母细胞时，不能使电压敏感性钠离子电流强烈表达，除非注射高浓度的 cRNA 并通过长时间孵育（Feng et al. 1995）。随后学者发现，由黑腹果蝇 TipE 基因编码的小蛋白质能增强 para 钠离子通道在非洲爪蟾卵母细胞中的表达，并且还可以使 para 钠离子通道发生动力学失活（Feng et al. 1995；Warmke et al. 1997）。这些结果表明 TipE 蛋白可能是钠离子通道的辅助亚基，其功能与作用方式类似脊椎动物钠离子通道β亚基。

钠离子通道,电压门控,拟除虫菊酯,抗药性

图 1-2 与拟除虫菊酯抗药性相关的昆虫电压门控钠离子通道突变位点（Dong et al., 2014Fig. 1-2 The pyrethroid resistance-associated mutation of voltage-gated sodium channel genes repoinsects (Dong et al., 2014)在 IIS6 上 L1014F 突变是第一个被发现与 kdr 抗药性相关的突变位点（Smith1997b；Vais et al. 2000）。自第一次在家蝇和蟑螂中报道该位点发生突变（Williamal. 1996；Dong 1997），学者还在其他昆虫发现该位点突变成 F，H，S，C 或 W 氨分析菊酯类抗药性种群发现，单个位点替换的多样性并不只有 L101（L1014F/H/S/C在电压门控钠离子通道其他位点也发现类似的替换，如 IS6 上的 V410（M/A/G/L）和上的 M918（T/L/V）。这些突变及替换位点的多样性可能与过去使用不同类型的菊杀虫剂有关。例如，钠离子通道上的 M918T 突变对苄氯菊酯和溴氰菊酯极不敏感et al. 2000），但其对 DDT 敏感（Usherwood et al. 2005），钠离子通道上 F1534C使其对 I 类型菊酯类杀虫剂不敏感，但对 II 类型菊酯类杀虫剂敏感（Hu et al. 201同样，L1014F，L1014H 和 L1014S 突变对 I 和 II 类型的菊酯类杀虫剂或 DDT 敏感不同（Burton et al. 2011）。
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S435.12

【参考文献】