樱桃谷肉鸭IRF1和IRF2基因克隆以及生物功能分析

发布时间：2020-02-18 02:34

【摘要】：干扰素(IFN)在天然的抗病毒免疫反应中具有重要的作用,而且干扰素还参与细胞的生长、分化以及免疫调节,是一类重要的细胞因子。其中干扰素调节因子(IRFs)对IFN以及干扰素诱导基因(ISGs)的转录过程具有很关键的作用。IRFs是一种重要的转录因子,它可以调节免疫反应特别是针对抗病毒感染,包括诱导IFN的产生以及激活补体和自然杀伤性细胞,进而增强免疫反应,它还参与造血反应。IRFs一共有11个成员(IRF1-IRF11),其中在哺乳动物和禽类动物检测出了10个成员,分别是IRF1、IRF2、IRF3、IRF4/PIP/LSIRF/ICSAT、IRF5、IRF6、IRF7、IRF8/ICSBP、IRF9/p48/ISGF3γ以及IRF10,IRF11目前只在鱼类中检测发现。这些成员在结构上共享保守区域:一个DNA结合区域(DBD);C末端一个IRF关联域(IAD)(IRF1、IRF2除外)。它们在结构上共享保守区域,但功能上不尽相同;IRF4和IRF8通过免疫细胞增加端粒酶活性;IRF7是干扰素的主调节器;IRF9可以识别IRF3复合物(ISGF3)这段碱基序列,而ISGF3的识别是IFN应对病毒刺激的一个关键过程;IRF10与IRF1功能有些类似,可以调节鸟苷酸结合蛋白的表达;IRF5可以结合到IFN和ISGs的启动子等作用。IRFs在进化分类上可以分为四个亚科:IRF1亚科(IRF1,IRF2,IRF11)、IRF3亚科(IRF3,IRF7)、IRF4亚科(IRF4,IRF8,IRF9,IRF10)、IRF5亚科(IRF5,IRF6)。在功能上分为三大类:活化剂(IRF1,IRF3,IRF9)、抑制剂(IRF8)、双功能(IRF2,IRF4,IRF5,IRF7)。IRF1对于研究动物疾病是一个不错的候选基因,也是一个具有多生物学功能的转录因子,参与抗病毒反应、细胞生长、细胞凋亡的调节。IRF2具有连同IRF家族成员形成复杂的IRF调控系统,并且影响抗原递呈、细胞周期以及抑制肿瘤等作用;但是IRF1、IRF2在鸭子上是否也具有相关功能目前还不清楚。鸭子在畜牧行业是一种很重要的物种,每年产肉(主要在亚洲)300万吨,具有很高的经济价值;但是每年鸭子因感染病毒造成巨大的经济损失,所以我们有必要了解鸭子的某些抗病毒机制,提高鸭子的抗病毒效果。本实验选取樱桃谷肉鸭作为研究对象,研究内容主要包括三部分:第一部分樱桃谷肉鸭IRF1、IRF2的克隆鉴定与进化分析。根据NCBI上公布的鸭IRF1、IRF2基因的保守区域设计引物,从正常樱桃谷肉鸭的脾脏中提取总RNA,通过普通PCR方法扩增IRF1、IRF2的ORF序列。其中IRF1的ORF序列长954bp,编码317个氨基酸;irf2的orf序列长1047bp,编码348个氨基酸;利用软件mega5.1对多个物种的irf1、irf2进行进化分析;结果显示与樱桃谷肉鸭同源性最高的是鸿雁(irf1、irf2可信度分别为93%、78%)。第二部分樱桃谷肉鸭上irf1、irf2与其他物种的氨基酸对比分析以及生物学功能分析。利用在线软件分析以及查阅相关文献,我们对比了樱桃谷肉鸭、鸡、鼠、人的irf1和irf2序列,结果显示这四个物种的氨基酸序列高度同源。参考其他文献发irf1可以分为五个区域:n端抑制域、dna结合域、核定位域、转录结构域和增强子区域。irf2可以也可分为四个区域:dna结合域、转录结构域、干扰素关联域和抑制域。第三部分樱桃谷肉鸭irf1、irf2在健康鸭各个组织的分布情况以及感染病毒(坦布苏病毒、新型呼肠弧病毒、鸭瘟病毒)之后irf1、irf2的消长规律。实时荧光定量pcr(qrt-pcr)分析结果显示樱桃谷肉鸭irf1和irf2基因在所有检测器官中均表达,但不同组织表达量有差异,正常情况下检测irf1表达的组织中当属肺脏最高,irf2的表达心脏、肝脏、肺脏检测的最高。为研究樱桃谷肉鸭irf1和irf2是否参与抗病毒免疫应答,本实验对樱桃谷肉鸭肌肉注射鸭瘟病毒、新型呼肠弧病毒以及坦布苏病毒。然后检测irf1、irf2基因在病毒感染1、3、5天后脾脏和大脑中的表达水平变化。结果表明,樱桃谷肉鸭irf1在感染病毒后1、3、5天后都迅速上调,其中鸭瘟病毒刺激后脾脏和大脑都是在1、3、5天上调倍数逐渐增加,都在第五天达到最大值(脾脏为7.33倍,大脑为7.95倍)。新型呼肠弧病毒刺激后,在1、3、5天都呈上调状态,在第一天达到峰值(脾脏为234.5倍,大脑为20.3倍)。坦布苏病毒刺激后,脾脏上调不是很明显,都在10倍以下;在大脑中上调非常明显,1、3、5天都达到100倍以上,其中第一天达到最大值459.2倍。鸭瘟病毒刺激鸭子后,樱桃谷肉鸭irf2在大脑和脾脏的表达都是上调的,其中第一天和第三天上调倍数比较平稳,脾脏约为35倍,大脑上调约为7倍;第五天达到最大值,脾脏上调151倍,大脑上调15倍。新型呼肠弧病毒刺激后,脾脏irf2第一天就达到最大上调倍数234.5倍,第三天和第五天也称上调趋势但是上调倍数逐渐减弱。大脑在第三天达到最大上调倍数8.6倍,不过这三天上调倍数较稳定。坦布苏病毒刺激鸭子后脾脏和大脑都是在第一天达到最大上调倍数,脾脏为52.3倍,大脑为371倍,其上调规律与新型呼肠弧病毒刺激规律相似。本研究表明,樱桃谷肉鸭中存在irf1和irf2这两个转录调节因子,且在健康鸭组织中广泛分布。在不同类型的病毒感染樱桃谷肉鸭后,irf1和irf2在大脑和脾脏中的表达量均上调,这表明这两个因子参与宿主的抗病毒反应。本项目的研究工作为进一步探究鸭IRF1和IRF2的抗病毒作用机理奠定了基础,有助于进一步认识鸭的先天性免疫系统。
【图文】：

调节因子,氨基酸,干扰素调节因子

transactivation domain和enhance domain（如图1所示）DU represent Cherry valley duck; CK represent Gallus; HU represent Homo sapiens; MS represent Mus musculus图1. 干扰素调节因子调节因子1的氨基酸对比结构Fig.1 AA contrast structure of IRF1IRF2的ORF全长序列1047bp,编码348个氨基酸。IRF2的蛋白序列包括4个区域，包括DNA binding domain 、Transacivating domain、Interferon Associate domain 2和Repression motif。（如图2）

序列,干扰素调节因子,调节因子,氨基酸

19DU represent Cherry valley duck; CK represent Gallus; HU represent Homo sapiens; MS represent Mus musculus图2 干扰素调节因子调节因子2的氨基酸对比结构Fig.2 AA contrast structure of IRF23.2 樱桃谷肉鸭 IRF1 和 IRF2 的进化树分析樱桃谷肉鸭IRF1和IRF2与其它已知序列IRF1和IRF2序列的高度相似性由进化树进一步支持。进化树是由25个来自哺乳类、鸟类、鱼类、爬行类的IRF1蛋白序列和IRF2进行构建的。如图3、图4所示，樱桃谷肉鸭IRF1和IRF2与同是鸟类的鸿雁、鸽子和原鸡的IRF1和IRF2同源性最高，，而与亲缘关系较远的哺乳类以及鱼类IRF1和IRF2同源性较低。（进化树构建所用序列见表2）
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S858.32

【参考文献】