【摘要】：许多双壳类贝类有两种线粒体遗传方式,一种通过精子传递线粒体基因组,一种通过卵子传递线粒体基因组。这种现象被称为线粒体基因组的双单亲遗传(doubly uniparental inheritance,DUI)。存在DUI现象的物种中,存在着两种异质性的线粒体DNA(mtDNA),被称为F型(F-type)和M型(M-type)mtDNA,F-type mtDNA随雌性亲本传递给雌雄后代,M-type mtDNA随雄性亲本传递给雄性后代。并且F、M-type mtDNA有很大的差异,单基因COII和ATP8的差异性较大。本实验首先对三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)F、M-type ATP8基因进行了克隆,得到了他们的cDNA全序列。在此基础上研究了三角帆蚌从胚胎时期到三龄成熟时期时F、M-type ATP8基因的表达差异,并对本实验室前期F、M-type COII基因在早期三角帆蚌中的表达情况进行了研究。同时通过对F-type ATP8基因在雌雄群体间的SNPs的关联性分析来建立有效区分三角帆蚌雌雄性别的分子标记。具体的研究内容如下:1.三角帆蚌F、M-type ATP8基因的克隆和结构分析首次获得了三角帆蚌F、M-type ATP8基因的cDNA全序列,其中F-type ATP8基因全长275bp,包含5’端非翻译区54bp,3’端非翻译区71bp,ORF区共150bp,编码49个氨基酸,所编码的氨基酸整体表现为疏水性。M-type ATP8基因全长222bp;5’端无UTR;3端非翻译区45bp;ORF区共177bp,编码58个氨基酸,所编码的氨基酸整体表现为疏水性。他们的不稳定系数分别为46.90和56.34,表明他们所编码的蛋白质性质不稳定。同源性分析发现,F-type ATP8基因与池蝶蚌的相似性最高,其次是与其他的淡水蚌类具有一定的相似性;而M-type ATP8基因相则与淡水蚌类的相似性不是太高,说明了相对于F-type ATP8基因,M-type ATP8基因在进化的过程中保守性较差。2.三角帆蚌F、M型COII基因和ATP8基因的表达荧光定量检测各时期各组织中M、F-type COII基因的表达。结果表明早期幼龄(胚胎期-5月龄)三角帆蚌的组织团中,M、F-type COII基因均能检测出,且同时期中F-type COII基因的表达量显著高于M-type COII;六月龄各组织中,M-type COII基因在性腺中表达量最高,相同组织中F-type COII基因的表达量仍处于较高水平。胚胎期到8月龄的三角帆蚌性腺部位组织团中,M、F-type ATP8基因在各时期均有表达,同时期对比发现,F-type ATP8基因的表达量明显高于M-type ATP8基因。一龄H.cumingii中,M、F-type ATP8基因在雌雄蚌的各组织中均能检测到,雌雄对比发现F-type ATP8表达丰度高于M-type ATP8,证实了F-type ATP8基因的主导地位。二龄H.cumingii中,F-type ATP8基因在雌雄各组织中均能检测到表达;M-type ATP8基因在雌雄各组织中仅在性腺中高表达,其余各组织中均是微量表达或不表达。在三龄三角帆蚌中,F-type ATP8基因在雌雄各组织中均能检测到,M-type ATP8基因在雌性各组织中的表达丰度都非常低,而在雄性各组织中,仅在性腺中高表达,其余组织中几乎检测不到。3.三角帆蚌F-type ATP8基因SNP位点筛选及雌雄群体差异性分析F-type ATP8基因DNA序列中检测到16个SNP位点,单核苷酸多态性比较丰富。对雄性和雌性群体中的SNP位点的关联性分析发现,只有少数被检测到的SNP位点不具有统计学差异。在M和F群体中基因型计学差异的有9个SNP,基因型和等位基因频率都存在差异的有4个SNP。外显子区域,E-33A-G,E-36T-G,E-40T-A,E-42T-A,E-109G-A,E-126A-G,E-150A-G,E-169G-A,E-182C-T位点基因型都存在极显著性差异(P0.01);E-64A-T,E-84A-G,E-87A-G,E-114T-C位点基因型存在显著性差异(P0.01),等位基因频率存在显著性差异(0.01P0.05)。其中,E-115-G位点的G/A基因型特异性存在于雌性群体中,在雄性群体中全部为G/G基因型。4.三角帆蚌精子存活率的研究利用曙红Y染色剂只能对死亡后的精子着色的原理对三角帆蚌精子存活率进行了研究,首先我们筛选出了曙红Y的最佳染色浓度为0.05%和最适染色时间为10min。三角帆蚌精子的存活率与温度成负相关的关系,既温度越高,死亡率越高,这一方面可能是因为温度升高会对精子本身造成一定的损伤导致死亡,另一方面可能是温度升高会增加精子被激活的数量,进而导致死亡率的上升。三角帆蚌精子的存活率还与水体中的离子浓度和种类有关,生理盐水中的死亡率略高于蒸馏水中,这可能与生理盐水中含有一定的Cl-有一定的关系。而在河道水系中,死亡率远高于其他水体环境中的死亡率,这说明了离子含量越高,死亡率也越高。
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S917.4
【参考文献】
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2581051
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