基因prtP编码的细胞膜丝氨酸蛋白酶lactocepin对副干酪乳杆菌免疫调节的影响
发布时间：2020-02-20 01:35
【摘要】：乳酸菌可以与肠道粘膜免疫系统相互作用,在抑制肠道致病菌、调节机体免疫功能、维持肠道微生态平衡等方面发挥重要作用。而乳酸菌发挥益生作用的前提是其与肠上皮细胞的粘附,粘附作用是菌株定植肠道的第一步。乳酸菌对肠道上皮细胞的粘附作用有助于其在肠道定植、增强乳酸菌与肠道细胞之间的交流、抑制病原菌在肠道的定植和提高机体免疫力。因而乳酸菌的粘附性是评价其作为益生菌的重要指标。最新研究发现,在乳酸乳球菌中,细胞外膜的丝氨酸蛋白酶lactocepin除了有水解蛋白质、抗炎等功能外,还能介导乳酸菌的粘附作用,主要是通过影响范德华力的改变。为了研究lactocepin是否介导乳酸菌的粘附,本文以副干酪乳杆菌为载体,用λ-Red重组系统敲除lactocepin的编码基因prtP,构建副干酪乳杆菌1 actocepin缺失突变株。并比较了突变株与亲本株在生物学特性、体内外粘附性以及对肠道免疫影响等的差异。主要的结果如下:比较副干酪乳杆菌亲本株与lactocepin缺失突变株菌的生长曲线、表面疏水性、自凝聚能力、抑制致病菌的能力及药敏性。结果表明,lactocepin缺失,副干酪乳杆菌生长速度减慢,疏水性和自凝聚能力显著下降,抑菌能力无明显变化,对不同抗生素的敏感性有所改变。副干酪乳杆菌亲本株对诺氟沙星、环丙沙星、多粘菌素B、链霉素均具有耐药性;对四环素和青霉素G中度敏感;对利福平、头孢唑林和头孢拉定均敏感,而lactocepin缺失突变株菌突变株对诺氟沙星、多粘菌素B和链霉素均有耐药性;对环丙沙星、青霉素G和头孢拉定中度敏感;对利福平、四环素、头孢唑林均敏感。本研究还测定了副干酪乳杆菌亲本株与lactocepin缺失突变株对小鼠巨噬细胞、脾脏细胞、肠上皮细胞以及肠黏液的粘附能力,建立了四种体外粘附模型。实验采取了镜检法、涂板法测乳酸菌对细胞的粘附性,荧光标记法测乳酸菌的体内粘附数。结果显示,lactocepin影响乳酸菌对不同细胞粘附性。在巨噬细胞上,亲本株粘附的数量为27.7±2.52个,lactocepin缺失突变株粘附的数量是19.3±3.06个,明显高于脾脏细胞的19.3±2.08个、10.7±1.53个和小肠上皮细胞的14.7±1.53个、8.3±1.53个,且亲本株对三种细胞的粘附量均显著高于突变株。亲本株对小鼠小肠黏液的粘附率为20.07±0.18%,突变株的粘附率为16.96±0.82%,亲本株显著高于突变株(P0.01)。本试验采用流式细胞仪分析了两株受试乳酸菌在小鼠肠道中的定植与分布。结果表明,亲本株与突变株在肠道中的定植情况不相同。突变株在肠道的定植主要发生在灌胃前期,回肠和结肠中都是在第1d定植量最多,十二指肠和空肠中都是在第3d定植得最多。亲本株在肠道的定植除在结肠是第一天定植量最多以外,都发生在灌胃后期。亲本株和突变株主要都是定植在结肠,十二指肠中最少。在不同肠段,亲本株的粘附量均显著高于突变株(P0.01)。采用CBA技术通过体内、外实验研究了受试乳酸菌对免疫器官、免疫细胞和免疫分子的影响。结果表明,发现亲本株与突变株都能在灌胃的中期提高小鼠的免疫器官指数,后期不明显;均能提高脾脏淋巴细胞转化率,但亲本株比突变株更显著;亲本株能显著提高巨噬细胞能量水平和吞噬能力(P0.05),突变株作用不显著。亲本株和突变株高剂量时均可以增加机体对IFN-α的表达量(P0.01),亲本株的表达效果更显著,亲本株可以增加机体对IL-10的表达量(P0.01),而突变株的作用效果不明显。亲本株可以增加机体对IFN-γ的表达量,且与剂量及时间有关,高剂量作用显著(P0.05),突变株作用不明显。两种受试乳酸菌在喂养小鼠的整个阶段均可提高CD11c+CD80+双阳性细胞的细胞的数量。
【图文】：
从而保证了邋Ｒｅｄ重组系统在宿主菌中进行瞬时表达，在完成了靶向基因的敲除的同时也对逡逑宿主菌本身重组系统影响较小。逡逑图１描述了Ｒｅｄ重组系统介导的基因敲除过程。首先是合成一对引物，每一条引物的５＇逡逑端有３５？６０ｂｐ，邋３ｆ端与筛选的基因同源，以抗药性的质粒作为模板，通过ＰＣＲ获得中间为逡逑一个筛选基因，，它的两端为３５？６０ｂｐ的同源臂（图１－１中Ａ和Ｂ）的线性的打靶的ＤＮＡ，把线逡逑性打靶的ＤＮＡ经过电击转化进入到含Ｒｅｄ重组系统的宿主菌后，重组系统进行适量表达，入逡逑核酸外切酶就结合到了线性的打靶的ＤＮＡ两同源臂末端，酶切产生游离３＇单链ＤＮＡ区逡逑段，从而以链侵入的方式使两同源臂与宿主染色体间发生重组。线性打靶ＤＮＡ插入到同源逡逑臂Ａ和Ｂ间，而八和８间的ＤＮＡ序列在宿主染色体上被其置换，对靶分子的定向敲除就完成逡逑了，从而获得靶向基因缺失的突变株。但是筛选基因（通常是抗药性基因）还存在于缺失突逡逑变株中
２结果逡逑２．１突变株的构建鉴定逡逑图２－１为突变株片段的ＰＣＲ扩增凝胶成像图。逡逑Ｘ逦Ｍ逡逑Ｍｕ逡逑篡—：二逡逑１１７５——邋＾000逡逑＇邋八S缅义希恚礤义贤迹玻蓖槐渲辏蹋穑冢郑颍灼蔚模校茫依┰鲥义希疲椋纾玻卞澹校茫义澹幔恚穑欤椋妫椋悖幔簦椋铮铄澹铮妫蹋穑冢椋穑郑靛澹妫颍幔纾恚澹睿簦诲澹卞澹蹋穑粒穑颍欤校诲澹停澹停幔颍耄澹蝈义
本文编号：2581177
【图文】：
从而保证了邋Ｒｅｄ重组系统在宿主菌中进行瞬时表达，在完成了靶向基因的敲除的同时也对逡逑宿主菌本身重组系统影响较小。逡逑图１描述了Ｒｅｄ重组系统介导的基因敲除过程。首先是合成一对引物，每一条引物的５＇逡逑端有３５？６０ｂｐ，邋３ｆ端与筛选的基因同源，以抗药性的质粒作为模板，通过ＰＣＲ获得中间为逡逑一个筛选基因，，它的两端为３５？６０ｂｐ的同源臂（图１－１中Ａ和Ｂ）的线性的打靶的ＤＮＡ，把线逡逑性打靶的ＤＮＡ经过电击转化进入到含Ｒｅｄ重组系统的宿主菌后，重组系统进行适量表达，入逡逑核酸外切酶就结合到了线性的打靶的ＤＮＡ两同源臂末端，酶切产生游离３＇单链ＤＮＡ区逡逑段，从而以链侵入的方式使两同源臂与宿主染色体间发生重组。线性打靶ＤＮＡ插入到同源逡逑臂Ａ和Ｂ间，而八和８间的ＤＮＡ序列在宿主染色体上被其置换，对靶分子的定向敲除就完成逡逑了，从而获得靶向基因缺失的突变株。但是筛选基因（通常是抗药性基因）还存在于缺失突逡逑变株中
２结果逡逑２．１突变株的构建鉴定逡逑图２－１为突变株片段的ＰＣＲ扩增凝胶成像图。逡逑Ｘ逦Ｍ逡逑Ｍｕ逡逑篡—：二逡逑１１７５——邋＾000逡逑＇邋八S缅义希恚礤义贤迹玻蓖槐渲辏蹋穑冢郑颍灼蔚模校茫依┰鲥义希疲椋纾玻卞澹校茫义澹幔恚穑欤椋妫椋悖幔簦椋铮铄澹铮妫蹋穑冢椋穑郑靛澹妫颍幔纾恚澹睿簦诲澹卞澹蹋穑粒穑颍欤校诲澹停澹停幔颍耄澹蝈义
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