棉铃虫ABC转运蛋白ABCG1的基因克隆和功能分析

发布时间：2020-02-26 21:22

【摘要】：长期种植转苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringiensis(Bt)基因作物使一些靶标害虫产生了Bt抗性,有人研究发现ABCG亚家族基因中的white(ABCG1)基因表达下调能够使小菜蛾Plutella xylostella产生Cry1Ac抗性,我们推测棉铃虫Helicoverpa armigera的ABCG1基因(HaABCG1)表达下调可能与棉铃虫对Cry1Ac毒素的抗性有关,即棉铃虫HaABCG1蛋白可能介导棉铃虫Cry1Ac抗性。首先,我们克隆并分析棉铃虫HaABCG1的开放阅读框(open reading frame,ORF);然后从棉铃虫体内和体外两方面分别研究ABCG1基因与Cry1Ac毒素的关系,通过构建含HaABCG1基因的表达载体检测HaABCG1蛋白在TnH5细胞中的亚细胞定位;通过细胞毒力实验验证棉铃虫HaABCG1蛋白与Cry1Ac毒素的关系;利用RNAi技术验证棉铃虫HaABCG1表达下调是否会降低棉铃虫对Cry1Ac毒素的敏感性。结果发现:1棉铃虫HaABCG1基因的克隆表达及蛋白序列分析棉铃虫HaABCG1基因的ORF由1 896个核苷酸组成,编码蛋白含631个氨基酸残基,分子质量约69.63 kDa,等电点是8.76。棉铃虫HaABCG1蛋白没有信号肽和O-糖基化位点,有4个N-糖基化位点,一个细胞质基质核酸结合域(nucleotide binding domain,NBD),一个含有6个α-螺旋的跨膜区(transmembrane domain,TMD)和ABC转运家族的特征性标记结构,这些均与ABCG亚家族的特征相符合。2棉铃虫HaABCG1基因的进化树分析对来自不同物种的37条蛋白序列构建进化树,分析表明,ABCG家族蛋白序列和ABCA1蛋白序列能够明显区别开来;昆虫ABCG1与非昆虫ABCG1具有很高的相似性,与昆虫ABCG4蛋白序列的相似性高于ABCG5蛋白序列和ABCG8蛋白序列。3 HaABCG1-GFP融合蛋白的亚细胞定位以及HaABCG1介导Bt毒素穿孔的细胞毒力功能验证构建带有GFP标签的棉铃虫真核表达质粒pEGFP-N1/HaABCG1,HaABCG1-GFP融合蛋白在TnH5细胞内表达,借助荧光显微镜观察其在细胞中的定位,HaABCG1主要分布在TnH5细胞的核膜和内质网膜上。HaABCG1-GFP融合蛋白在TnH5昆虫细胞表达24 h后,当处理细胞的Cry1Ac,Cry2Aa,Cry1Ca和Cry1Fa这4种毒素处理1 h后,TnH5细胞同阴性对照一样几乎没有发生病变,而表达HaABCC2-GFP和HaCad-GFP的阳性对照细胞膨胀破裂,即HaABCG1不是Cry1Ac,Cry2Aa,Cry1Ca和Cry1Fa 4种毒素的受体。4基于RNAi和生物测定的棉铃虫HaABCG1基因功能验证干扰72 h后,一部分棉铃虫幼虫用于提取RNA,反转录并进行实时荧光定量;另一部分幼虫用于生物测定实验,在含0.05μg/mL Cry1Ac的饲料上饲养3 d。对照组和实验组者的死亡率没有显著性差异;在干扰效率高于40%时,对照组和处理组幼虫的体重都有所下降,对照组注射无RNase水的幼虫体重的减少量大于注射siABCG1的;通过方差分析结果看出,对照组和处理组幼虫的体重变化没有显著性差异。通过体内和体外两个方面的实验我们总结出,棉铃虫HaABCG1基因的表达下调与棉铃虫对Cry1Ac的抗性不相关,棉铃虫的HaABCG1不是Cry1Ac毒素的受体。这是首次报道ABCG1基因不参与棉铃虫的Cry1Ac抗性。
【图文】：

图 1 Cry 和 Cyt 毒素蛋白的三维立体结构Fig.1 Three-dimensional structure of three-domain-Cry and Cyt proteins素有三个蛋白域。蛋白域I（灰色带状），由7个α-螺旋组成，结构域II 和 III由β-折叠组成（分别是Cyt毒素仅仅有一个α-β蛋白域，α-螺旋发夹外层包围着一个β-折叠，N-末端（白色带状）含有所有的端（黑色带状）含有一个β-折叠（Li et al., 1991）。Cry proteins are composed of three domains. Domaingrey ribbons), is abundle of seven α-helices and domains II and III (shown in white and black ribbons, respormed by β-strands. Cyt proteins are composed of a single α-βdomain. N-terminal fragment (shown in whitntains all a-helices and C-terminal fragment (shown in black ribbons) is a β-sheet composed of β-strands（1991）.Bt 毒蛋白 Cry 毒素的结构 Cry 毒素经明确结构组成的 Cry 毒素对鳞翅目、双翅目、鞘翅目和线虫具有特殊的些毒素具有相似的结构。随着分子生物技术、X-射线和核磁共振（NMR革和发展，人们对蛋白结构在原子能级的认识和功能的认识有了更深的理

棉铃虫 ABC 转运蛋白 ABCG1 的基因克隆和功能分析连锁（Gahan et al., 2001; Xu et al., 2005; Morin et al., 2003; Xu et al., 2014; Xie et al.;2005）。很多研究也发现 Cadherin，APN 及 ALP 的下调表达与抗性产生有关（Tiewsiri &Wang, 2011; Jurat-Fuentes et al., 2011）。有研究表明某些抗性品系中 ALP 的上调表达可能与抗性产生有关，这可能是 ALP 从中肠细胞 BBMV 上脱落导致的，也可能与可溶性及锚定性 ALP 的比例变化有关系（Caccia et al., 2012）。究其变化的根源，，很可能有相关受体糖基化过程发生变化有关（Griffitts et al., 2001; Griffitts et al., 2005; Zielinska et al.,2010）。靶标害虫 Bt 作用机理的研究不断取得重要突破，但仍有许多具有 Bt 抗性的种群，其抗性机理尚未阐述清楚。
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S433

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