骨质疏松发病与Bcl-2、CXCL12基因表达的关系

发布时间：2020-03-17 21:26

【摘要】：背景:骨质疏松(Osteoporosis,OP)是指全身骨质量和骨密度减少以及骨组织微结构退变,进而导致骨强度降低,骨脆性增加,并伴随着病理性骨折的发生。OP随年龄的增长变得越来越普遍,在墨西哥50岁以上的人群约45%患有OP,且女性比男性更常见,比率高达9%-38%。据统计欧盟约有2200万妇女和550万男子患有OP,且白人和亚洲人患病几率更高,此外由OP导致的骨折发病率已超过心肌梗死、中风等疾病,极大地危害人们健康。美国第3次全国营养与健康调查,全国50岁以上男女骨质疏松患病率分别是3%-6%和13%-18%。我国作为一个进入老龄化阶段的人口大国,在未来一段时间内骨质疏松的患病人数会逐年不断增加。OP的发病机制十分复杂,目前尚没有完全研究清楚。涉及到骨重塑功能障碍、抑制性免疫调节紊乱、骨分化抑制以及维生素D缺乏、激素调节等多种因素。目前已知研究的是在骨重塑的生理过程中,骨吸收和骨形成平衡是由成骨细胞(Osteoblast)和破骨细胞(Osteoclast)维持的,成骨细胞移动到吸收部位通过分泌骨基质,骨基质矿化而形成新骨。破骨细胞可在多位点对骨基质进行吸收和降解作用,而成骨细胞则会在骨吸收区分化形成新的骨组织,而OP的发生正是由于骨吸收大于骨形成,骨平衡被打破导致的。但是骨形成和骨吸收过程中的具体分子信号传导通路、参与基因、调控方式等生物学机制尚无明确答案。已知的研究表明在正常骨骼中,骨基质重塑是恒定的,该过程由成骨细胞和破骨细胞组成的骨代谢单元(BMUs)维持。但在OP模型中,破骨细胞降解骨骼基质的速度快于成骨细胞重建骨骼,从而使骨量丢失加快,新骨形成减慢,骨密度降低。在骨重建过程中,BMUs分泌的细胞因子作用显著,其中破骨细胞分泌的OPG/OCIF可抑制成骨细胞传导通路和破骨细胞生成;TGF-β可促进骨髓成骨细胞祖细胞增殖,使成骨细胞数量增多;IGF-1可刺激成骨细胞增殖分化,增加骨钙素产生等。此外,激素在骨重建及骨吸收过程中也扮演着重要的角色,研究表明缺乏雌激素可增加骨吸收,以及减少新骨沉积。雌激素与雌激素受体(ER)结合在骨转换过程中发挥重要的作用。雌激素与ER结合可刺激成骨细胞分化,增加骨基质沉积;破骨细胞前体中ERα高表达,但在成熟破骨细胞中却不表达;另外雌激素可通过调节c-Jun表达及其N端激酶磷酸化抑制骨吸收,此外,甲状旁腺激素(PTH)及钙降素可通过调节骨钙代谢在骨转换及骨质沉积中起重要作用。近年来有研究表明基因多态性也与OP有关,可决定OP的遗传倾向,并影响雌激素治疗OP。OP的发生是由多因素参与和影响的非常复杂的过程。通过各种信号通路及其下游靶基因调控成骨细胞和破骨细胞的增殖以及凋亡,导致骨量减少,引发骨折。其中NF-κ B信号通路与OP病理过程紧密相关。研究表明p50/p52基因敲除的小鼠中破骨细胞生成受到抑制;且成骨细胞分泌的多种细胞因子可促进其细胞内NF-κ B的活化。此外,双敲除NF-κ B1和NF-κ B2的小鼠模型中破骨细胞分化受到抑制。NF-κB通路下游的靶基因,如凋亡因子家族、趋化因子等在细胞增殖、分化、凋亡、肿瘤生成及疾病代谢中发挥重要的作用。绝经后女性雌激素分泌减少,从而与成骨细胞表面的雌激素受体结合降低,促进细胞因子释放,进而使NF-κB异常活化,影响下游靶基因表达(如凋亡因子家族、趋化因子、肿瘤坏死因子等),使成骨细胞增殖分化受到抑制,引发OP病变。研究表明,雌激素可抑制造血干细胞以及成骨细胞等分泌多种细胞因子,如IL-1、TNF、GM-CSF等,而这些因子可促进破骨细胞增殖分化并抑制其发生凋亡;此外破骨细胞的活化受多种信号分子调节,其中RANKL(NF-κB配体的受体激活剂)研究广泛,其由成骨细胞产生,并刺激RANK(NF-κB的受体激活剂),使NF-κB通路以及破骨细胞的骨吸收能力受到抑制。趋化因子配体12(CXC Ligand 12,CXCL12),即基质细胞衍生因子-1(SDF-1),是NF-κB通路下游相关的靶基因,其在脑、胸腺及骨髓等组织中均有表达,对淋巴细胞和充质间干细胞具有很强的趋化性,且有研究表明CXCL12在炎性骨损坏区高表达,对破骨细胞生成具有抑制作用。Bcl-2蛋白作为Bcl-2家族中抗凋亡蛋白的代表,其作用机理是是通过抑制线粒体的通透性的改变来抑制细胞凋亡的,与之相关的主要包括抑制氧化剂诱导的细胞凋亡、抑制细胞内钙离子的跨膜运动和形成离子通道抑制细胞凋亡。到目前为止,国内外学者关于NF-κB信号通路对骨质疏松的影响的研究较少,NF-κB信号通路对成骨细胞和破骨细胞的作用机制尚不明确。因此,研究NF-κ B信号通路与骨平衡机制的关系对破解骨质疏松这个世界性难题具有极其重要的意义。由此,我们得到启发,Bcl-2、CXCL12能否成为影响骨质疏松的目标基因?调控NF-κB信号通路对成骨细胞和破骨细胞有何影响?能否通过调控NF-κB信号通路及其下游的Bcl-2、CXCL12基因的表达来研究骨质疏松发病的新机制?为预防和治疗骨质疏松症探索新靶点和新方法。第一章:骨质疏松患者细胞增殖、凋亡及成骨能力检测研究目的:本研究中对骨质疏松(Osteoporosis,OP)组患者和对照组(正常和低骨量组,也即非骨质疏松组)患者行髋关节置换手术取下的股骨颈组织进行成骨细胞和破骨细胞的分离培养,对比研究两组患者成骨细胞和破骨细胞的增殖和凋亡状况、成骨细胞成骨能力。并为第二章的实验提供传代培养的成骨细胞和破骨细胞。研究方法:收集2015年3月至2016年7月我院骨科住院的需进行髋关节置换手术的绝经期女性患者60例,平均年龄62±7.83岁,并根据双能X线骨密度检查结果分为骨质疏松组(OP,n=32,平均年龄64±6.78岁)和对照组(正常和低骨量组CK,n=28,平均年龄61±8.53岁),对不同意研究、继发性OP以及近几月服用过影响骨代谢药物的患者予以病例排除。所有受试患者及其家人均得到告知且签署研究同意书,并符合伦理道理标准,组间年龄差距无显著性差异(P0.05);术后将松质股骨颈取下,并采用Robey PG等人报道的方法进行成骨细胞分离培养,以及参照Machonal等人报道的方法进行破骨细胞的分离培养;并对成骨细胞和破骨细胞进行形态学检测。对各组传代培养的成骨细胞及破骨细胞每隔12h进行活细胞计数与分析,利用酶标仪在波长490nm处检测各组细胞吸光值,数据以相比于对照组中平均活细胞比例表示细胞的增殖情况检测。细胞凋亡分析是在传代培养后的48h,参照试剂盒操作,对成骨、破骨细胞进行Annexin V-FITC/PI双染色,于BDFACSCalibur流式细胞分析仪上分析早、晚期细胞凋亡率;对两组成骨细胞进行成骨诱惑,并于第7d和14d对成骨细胞进行碱性磷酸酶(ALP)和骨钙素含量检测;持续诱导21天后使用茜素红对成骨细胞的矿化程度进行检测。Real-time RT-PCR检测CK组和OP组成骨细胞诱导7天后ALP基因的表达情况。结果:两组成骨细胞和破骨细胞诱导成功。1、利用MTTL比色法检测两组成骨细胞和破骨细胞的增殖情况,结果显示OP组与CK组相比,成骨细胞增殖随培养时间延长显著受到抑制,破骨细胞增殖则显著增强。2、AnnexinV/PI双染色法检测两组细胞凋亡情况,结果显示与CK组相比,OP组成骨细胞早晚期细胞凋亡比率显著升高,破骨细胞早晚期细胞凋亡比率显著降低。3、对CK组和OP组原代培养的成骨细胞进行成骨诱导,在第7天和14天对细胞进行ALP活性和骨钙素含量检测,ALP活性检测的结果显示OP组成骨细胞的ALP活性明显低于CK组,成骨诱惑第7天,骨质疏松组成骨细胞ALP活性比对照组低34%,第14天,ALP活性比对照组低36%,(P0.05),对照组的ALP的表达明显高于OP组。骨钙素含量检测结果显示骨质疏松组成骨细胞的骨钙素含量明显低于对照组,成骨诱惑第7天,骨质疏松组成骨细胞骨钙素含量比对照组低2.5 ng/u g,第14天钙离子浓度比对照组低5.1 ng/ug,(P0.01)。4、钙结节数目检测结果显示骨质疏松组成骨细胞中钙结节数目明显低于对照组。5、CK组和OP组成骨细胞成骨诱导7 d后进行ALP的基因表达检测,检测结果显示,CK组的ALP的基因表达明显高于OP组,(P0.05),其结果具有统计学差异。本实验说明,对照组成骨细胞的成骨能力明显强于骨质疏松组。结论:通过对ALP、骨钙素、钙结节数量等检测指标的对比研究,证实骨质疏松发病过程中成骨细胞的增殖及成骨能力明显降低;破骨细胞的增殖能力和活性明显增强。与对照组相比,骨质疏松组患者总的成骨能力显著降低。通过对人体骨质疏松模型中提取的成骨细胞和破骨细胞进行离体培养和增殖,为第二章的实验提供传代培养的细胞。第二章:骨质疏松发病与Bcl-2、CXCL12及NF-κ B信号通路的关系研究目的:研究在NF-κ B信号通路下干预Bcl-2和CXCL12基因表达对骨质疏松的影响规律,从分子生物学及信号通路水平探索骨质疏松发病的新机制,为OP的预防及治疗探索新机制和新方法。研究方法:第一章培养的细胞传代培养后l0d的成骨细胞及破骨细胞中总RNA的提取鉴定,采用荧光定量PCR检测两组成骨细胞和破骨细胞的内Bcl-2、CXCL12及NF-κ B mRNA水平。将传代培养10d后的成骨细胞和破骨细胞于细胞裂解液中裂解,提取蛋白质,并使用蛋白质印迹法检测两组成骨细胞和破骨细胞的内Bcl-2、CXCL12 及NF-κ B 蛋白水平。将Bcl-2 siRNA,CXCL12 siRNA及NF-κ B siRNA的转染至正常组成骨细胞和破骨细胞中,RT-PCR检测转染细胞中Bcl-2及CXCL12表达情况,并检测其对细胞增殖和凋亡的作用,对成骨细胞中ALP活性和骨钙素进行测定。购买SPF级正常小鼠24只和Bcl-2基因敲除小鼠24只,测定其成骨细胞及破骨细胞的增殖能力,并检测其骨钙素,ALP及NF-κB水平。结果:对OP组和CK组的传代培养细胞进行荧光定量PCR检测Bcl-2和CXCL12 mRNA水平,Bcl-2的检测结果显示CK组成骨细胞中Bcl-2的表达明显高于OP组,(P0.01);破骨细胞中的Bcl-2的表达:CK组明显低于OP组,(P0.01)。CXCL12检测结果显示成骨细胞中CXCL12的表达,CK组高于OP组,(P0.05);破骨细胞中CXCL12表达,CK组明显低于OP组,(P0.01)。NF-κ B检测结果显示成骨细胞中NF-κ B的表达,CK组低于OP组,(P0.05);破骨细胞中NF-κ B表达,CK组明显高于OP组,(P0.01)。蛋白质印迹法检测两组细胞中Bcl-2和CXCL12的蛋白表达情况,结果表明较CK组,OP组成骨细胞内Bcl-2和CXCL12蛋白水平显著降低,NF-κB表达明显增加;而OP组破骨细胞内Bcl-2和CXCL12蛋白水平显著增加,NF-κB表达明显降低。Bcl-2 siRNA及CXCL12 siRNA的转染成功。低表达Bcl-2基因能有效的抑制成骨细胞和破骨细胞的凋亡;低表达CXCL12有效的促进成骨细胞和破骨细胞的增殖。低表达Bcl-2及CXCL12降低了成骨细胞的ALP活性和骨钙素含量。低表达NF-κ B促进了成骨细胞和破骨细胞的增殖,抑制成骨细胞和破骨细胞的凋亡(P0.05)。通过动物实验证实Bcl-2基因敲除组成小鼠的骨细胞增殖能力显著下降,破骨细胞增殖能力显著上升(P0.01)。Bcl-2敲除小鼠原代培养的成骨细胞的碱性磷酸酶的活性明显低于对照组(P0.05)。成骨诱导第14天,骨质疏松组称骨细胞ALP活性比对照组低38%(P0.05)。成骨诱导第7天及第14天,Bcl-2敲除小鼠组成骨细胞骨钙素含量比对照组低,(P0.01)。对照组成骨细胞中NF-κB表达低于Bcl-2敲除组(P0.01);破骨细胞蛋白检测结果显示对照组NF-κ B表达高于Bcl-2敲除组(P0.01)结论:Bcl-2和CXCL12基因异常表达可导致骨形成与骨吸收平衡被打破。选择性抑制NF-κ B信号通路可以减少其下游Bcl-2和CXCL12基因的表达,导致细胞凋亡,抑制破骨细胞分化进而抑制骨吸收。敲除Bcl-2基因可以反向影响NF-κB基因的表达,影响NF-κB信号通路的活化。Bcl-2和CXCL12表达水平降低可能是绝经后骨质疏松症(PMO)成骨能力受损和趋化活性降低的关键原因。通过调节NF-κ B信号通路及其下游Bcl-2和CXCL12基因表达可以调控成骨细胞和破骨细胞的增值与凋亡。对NF-κ B信号通路及其下游靶基因的调控可以为预防和治疗骨质疏松症提供新的研究靶点。
【图文】：

形态图,破骨细胞,形态,成骨细胞

对两组骨组织分离培养的成骨细胞进行改良Ｇｏｍｏｒｉ碱性磷酸酶钙钴法染色逡逑鉴定细胞形态。成骨细胞被染色呈棕黑色细微颗粒，而阴性对照细胞内无棕黑微逡逑粒（图２．１）。低倍显微镜下任选１０个视野，每个视野计数１００个细胞。对两逡逑组细胞进行成骨细胞纯度检测，发现了两组细胞的纯度均在９０％以上，这就说明逡逑本研究中成骨细胞分离培养成功，为后期的实验奠定基础。逡逑柋邋＾逡逑｜邋ｆ逡逑图２．邋１ＡＬＰ染色鉴定成骨细胞形态逡逑Ｗ，邋ｉ邋Y"邋１邋彳入￥邋ｖ＇；逡逑图２．邋２ＴＲＡＰ染色鉴定破骨细胞形态逡逑对两组骨组织分离培养的破骨细胞进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色（ＴＲＡＰ）观逡逑察与鉴定破骨细胞进行细胞形态。两组细胞在显微镜下观察均发现ＴＲＡＰ染色的逡逑细胞，细胞核阴性染色，呈黄色，核数可多达十几个，其颜色不均匀，呈典型的逡逑“荷包煎蛋”样形态（图２．２）。这就说明本研究中破骨细胞分离培养成功，为逡逑后期的实验奠定基础。逡逑３４逡逑

形态图,成骨细胞,形态,分离培养

对两组骨组织分离培养的成骨细胞进行改良Ｇｏｍｏｒｉ碱性磷酸酶钙钴法染色逡逑鉴定细胞形态。成骨细胞被染色呈棕黑色细微颗粒，，而阴性对照细胞内无棕黑微逡逑粒（图２．１）。低倍显微镜下任选１０个视野，每个视野计数１００个细胞。对两逡逑组细胞进行成骨细胞纯度检测，发现了两组细胞的纯度均在９０％以上，这就说明逡逑本研究中成骨细胞分离培养成功，为后期的实验奠定基础。逡逑柋邋＾逡逑｜邋ｆ逡逑图２．邋１ＡＬＰ染色鉴定成骨细胞形态逡逑Ｗ，邋ｉ邋Y"邋１邋彳入￥邋ｖ＇；逡逑图２．邋２ＴＲＡＰ染色鉴定破骨细胞形态逡逑对两组骨组织分离培养的破骨细胞进行抗酒石酸酸性磷酸酶染色（ＴＲＡＰ）观逡逑察与鉴定破骨细胞进行细胞形态。两组细胞在显微镜下观察均发现ＴＲＡＰ染色的逡逑细胞，细胞核阴性染色，呈黄色，核数可多达十几个，其颜色不均匀，呈典型的逡逑“荷包煎蛋”样形态（图２．２）。这就说明本研究中破骨细胞分离培养成功，为逡逑后期的实验奠定基础。逡逑３４逡逑
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R580

【参考文献】