低温胁迫下斑马鱼bmp10，dusp1分子调控机制的研究及gsdf转基因品系的构建

发布时间：2020-03-19 02:25

【摘要】：鱼类作为变温动物,温度是鱼类生存过程中最重要的环境因素之一,它不仅决定了鱼类的分布,且直接和间接的影响着鱼类的生理功能和行为。在细胞和分子水平,低温不仅会大大降低酶促反应和体内转运速率,还会诱导蛋白质变性、抑制转录和翻译、破坏细胞骨架结构和改变细胞膜通透性等,此外,冷应激还会改变细胞脂双层的特性,包括相变和脂肪酸组成。鱼类的鳃组织直接暴露于外环境中是鱼类感知外部环境压力的第一个器官。鳃对鱼类适应外部环境温度的变化和调节体内生理反应起到至关重要的作用。本实验前期运用CRISPR/CAS9技术分别敲除斑马鱼的bmp10(bone morphogenetic protein 10,bmp10)和dusp1(dual-specificity phosphatase 1,dusp1)基因,发现bmp10和dusp1在低温环境下对斑马鱼的鳃组织凋亡有明显的调控作用,但引起凋亡的分子机制仍不清楚。Bmp10属于TGF-β超家族成员,已有研究证明bmp10在小鼠心脏发育过程中具有重要作用,但在斑马鱼的研究中还缺乏相关报道。本实验室前期运用CRISPR/CAS9技术敲除斑马鱼bmp10基因,成功获得能稳定遗传的F2代,研究发现低温环境下bmp10在鱼类鳃组织细胞凋亡过程中起着重要的调控作用。但其具体的分子调控机制还不清楚。因此,本研究以前期获得的bmp10~(-/-)纯合突变体斑马鱼为研究对象,发现与野生型斑马鱼相比,bmp10~(-/-)纯合突变体斑马鱼在低温环境下P53蛋白表达水平明显增加。同时bmp10~(-/-)纯合突变体斑马鱼在低温环境下P53及其靶基因的mRNA表达水平会迅速升高,鳃组织发生凋亡产生严重损伤,加快bmp10~(-/-)纯合突变体斑马鱼的死亡。双特异性磷酸酶-1(DUSP1/MKP1)作为苏氨酸-酪氨酸双特异性磷酸酶家族的成员,最初在培养的鼠科细胞中被发现。先前的研究表明,dusp1是通过介导细胞外信号调节蛋白激酶的去磷酸化作用行使功能。且在细胞的增殖,分化和凋亡过程中具有重要的调控作用,本实验室前期的研究发现dusp1~(-/-)纯合突变体斑马鱼在低温环境下鳃组织细胞的凋亡明显增加,但引起鳃组织发生凋亡的相关分子调控机制尚不清楚,本研究通过对前期获得的dusp1~(-/-)纯合突变体斑马鱼蛋白水平的检测发现,dusp1~(-/-)纯合突变体斑马鱼在低温环境会导致鳃组织细胞凋亡显著增加,主要是由于MAPK通路中的P38和ERK的磷酸化水平增加,从而加快了鳃组织细胞凋亡,导致鳃组织产生损伤。Gsdf是TGF-β超家族的一个特异成员,主要在硬骨鱼类雄性性腺中表达,但在精巢发育过程中的具体分子调控机制尚未清楚。因此,本研究以斑马鱼为研究对象,构建了以小鼠gamma-crystalin启动子启动的Tg(Crystal-pro-gsdf-2A-egfp)荧光素酶报告质粒,采用显微注射技术注射Tg(Crystal-pro-gsdf-2A-egfp)质粒至1细胞期的斑马鱼受精胚胎中。在倒置荧光显微镜下观察和筛选,最终获得19条能够在斑马鱼眼部晶状体特异性表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的嵌合体F0代,然后将表达了绿色荧光蛋白的斑马鱼同野生型(WT)非转基因斑马鱼杂交,最终获得能稳定遗传和表达绿色荧光蛋白的F2代。综上所述,本研究主要揭示了斑马鱼bmp10和dusp1在低温应激过程中鳃组织细胞凋亡调控的相关分子机制,为研究低温对鱼类生长发育的影响提供了重要的理论依据。同时,成功建立了Tg(Crystal-pro-gsdf-2A-egfp)斑马鱼转基因品系,为观察和研究gsdf在精巢发育过程和分子调控机制方面的作用提供了新的方法。总之,研究在低温环境中的相关基因对斑马鱼正常生长发育的影响和性别关键基因在斑马鱼雌雄分化过程中的功能作用,对了解鱼类适应寒冷进化和鱼类性别分化等都有重要的科学意义,同时也为培育抗寒抗冻新种和全雄经济鱼类奠定了重要的生物学基础。
【图文】：

实验室先前运用 CRISPR/CAS9 技术分别敲除斑马鱼的 bmp10 和 dusp1 基发现在低温环境处理下，bmp10-/-纯合突变体和 dusp1-/-纯合突变体斑马鱼与野型斑马鱼鳃组织的凋亡相比均出现显著的差异，如图（2-2）和图（2-3）所示，低温处理 6h 后，bmp10-/-纯合突变体和 dusp1-/-纯合突变体斑马鱼鳃组织的细胞亡数均显著大于野生型斑马鱼鳃组织细胞凋亡数目，而在 28℃条件下，bmp纯合突变体和 dusp1-/-纯合突变体斑马鱼与野生型斑马鱼鳃组织细胞凋亡数目无显著性的差异。因此推测 bmp10 和 dusp1 可能参与斑马鱼低温应激过程，低环境下 bmp10 和 dusp1 的缺失促使斑马鱼鳃组织细胞凋亡明显增加，通过 H色法观察鳃丝的病理变化。结果发现，bmp10-/-纯合突变体斑马鱼在常温下，鳃片的基部有轻微的水肿现象，而在经过低温后，bmp10-/-纯合突变体斑马鱼与野型斑马鱼相比鳃小片发生更加明显的水肿，并且鳃组织上皮细胞出现缺失，红胞减少，，最终阻碍氧气的运输而导致死亡，这些现象表明 bmp10 在低温环境下斑马鱼的鳃组织具有保护作用。

上海海洋大学硕士学位论文图2-3 dusp1-/-纯合突变体和野生型在28℃和8℃6h鳃组织细胞凋亡检测结果Fig.2-3 Apoptosis results of dusp1-/-homozygous mutant and wild type at 28°C and 8°C for6 h同时用HE染色法检测分析bmp10-/-纯合突变体斑马鱼与野生型斑马鱼心脏的病理变化。结果发现，bmp10-/-纯合突变体斑马鱼与野生型斑马鱼相比心肌细胞排列出现明显的紊乱，且心肌细胞的数目显著减少，8℃低温处理 6h 后发现 bmp10-/-纯合突变体斑马鱼心肌细胞减少更明显，而野生型斑马鱼无论是在 28℃还是 8℃心肌细胞均排列整齐致密无显著性的差异和变化，因此得出结论斑马鱼 bmp10 的缺失致使心脏心肌细胞数目显著减少，表明 bmp10 对斑马鱼的心脏发育至关重要（图 2-4）。但 bmp10 的缺失引起这些变化的具体分子调控机制仍不清楚。
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S917.4

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本文编号：2589557