苹果多肽编码基因MdCEP1的克隆及功能鉴定
发布时间：2020-03-19 11:27
【摘要】：植物激素广泛参与了植物的生长、发育以及抗逆等过程,在植物生命活动过程中发挥了重要作用。植物多肽激素是一类经过蛋白酶体剪切后形成的具有特殊功能的成熟的多肽,其长度通常小于20个氨基酸,并且在植物体内含量极低。近年来的研究表明,植物体内的多肽激素通过细胞与细胞之间的信息传递参与到植物发育系统和适应极端环境条件的调控过程。CEP(C-TERMINALLY ENCODED PEPTIDE)基因编码一个小肽前体,由N端分泌信号肽、可变域、一个或多个CEP结构域和一个短的C末端延伸组成。研究表明,CEPs参与了植物根形态构建、侧根发生以及根瘤形成等过程。本研究中以‘嘎拉’苹果为研究对象,通过同源序列比对,获得苹果中与拟南芥AtCEP1同源性最高的基因MDP0000886459,将其命名为MdCEP1。分析其启动子顺式作用元件和对生长素的响应;并通过合成成熟的MdCEP1p~(Hyp)多肽以及在拟南芥中异源表达MdCEP1分析其对根系生长发育的作用。通过在苹果愈伤组织中过表达MdCEP1分析其对苹果花青苷积累的影响。主要研究结果如下:1.苹果MdCEP1基因生物信息学与表达模式分析染色体定位分析显示苹果MdCEP1基因位于苹果第15号染色体。基因结构分析显示MdCEP1只有一个外显子,无内含子。结构域分析表明MdCEP1包含一个信号肽结构域和一个CEP结构域。进化树分析显示苹果MdCEP1与白梨PbCEP1亲缘关系最近,同源性最高。启动子分析显示MdCEP1启动子序列含有与分生组织相关的CAT-box元件,赤霉素响应元件(P-box),并且含有光响应元件(MNF1)和与类黄酮合成相关的MYB类蛋白结合位点(MBSI)。表达模式分析显示,MdCEP1主要在苹果根和茎中表达。生长素响应分析显示,苹果MdCEP1对不同浓度的IAA均有明显响应。以上结果表明MdCEP1可能在不同方面参与了苹果生长发育的调控。2.苹果MdCEP1基因调控拟南芥根系发育为了研究MdCEP1的功能,首先合成了MdCEP1蛋白在植物体中的活性成分-成熟的MdCEP1p~(Hyp)多肽,配制含有不同浓度MdCEP1p~(Hyp)的培养基。对拟南芥培养发现,拟南芥的主根变短,侧根数目明显减少,并且随MdCEP1p~(Hyp)浓度的提高,抑制作用明显加强。进一步在拟南芥中异位表达MdCEP1,发现转基因拟南芥的主根长度和侧根数同样受到明显抑制。qRT-PCR结果显示,无论是MdCEP1p~(Hyp)处理的拟南芥还是过表达MdCEP1的拟南芥,生长素相关基因均明显下调,说明MdCEP1可能是通过影响生长素负调控植物根系的生长。3.苹果MdCEP1基因调控花青苷积累通过农杆菌介导的遗传转化获得MdCEP1转基因苹果愈伤组织。进一步分析发现,在低温强光下MdCEP1转基因苹果愈伤组织比野生型呈现出明显的花青苷积累的表型。qRT-PCR分析显示过表达MdCEP1能够明显促进苹果花青苷合成相关基因的表达。MdCEP1在拟南芥中异位表达,同样能够促进拟南芥中花青苷的积累,并且促进拟南芥花青苷合成相关基因的表达。研究结果表明,Md CEP1能够正调控苹果花青苷的合成。
【图文】：
图 1-1 植物中生长素的合成途径（Mashiguchi et al.，2011）Fig. 1-1 IAA Biosynthesis Pathway in Plants.2 生长素的运输长素的运输过程十分复杂，以极性运输为主，并且涉及到许多蛋白的精生长素的极性运输主要依赖于细胞内特异的运输载体实现。最早发现的入载体为 AUXI（AUXIN RESISTANTI），研究表明 AUX1 主要分布根，中柱细胞和源生韧皮部细胞，能够特异性的介导生长素由质膜外进入控根系发育（Bennett and Feldmann, 1996）。在 aux1 突变体中生长素的受到明显影响，根的向地性丧失；以自由扩散方式进入细胞内的外源 N复 aux1 突变体的表型，但需要主动运输的外源 2,4-D 无法恢复其表miro et al., 2001）。随后的研究表明与 AUXI 同源的 LAX1、LAX2 和 LAE AUXIN RESISTANT ） 同 样 具 有 生 长 素 输 入 载 体 的 功rtecheachirino et al., 2010）。
图 1-2 花青苷代谢途径（Petroni and Tonelli, 2011）Fig. 1-2 Anthocyanin metabolic pathways1.2.3 光照对花青苷的调控光照是花青苷合成过程中不可或缺的环境因子（Saure, 1990）。研究发现，苹果树冠内光照分布的不同对苹果果实花青苷的积累、果实含水量和可溶性固形物含量具有明显影响（张晶楠等，2010）。通过运用不同光质照射富士苹果，观察果实着色发现：UVB 光源照射富士苹果能够使果实含糖量和 PAL 酶活性显著增加，并且使果皮表面花青苷含量明显增加，促进了富士苹果的着色。分析显示，糖分的积累能够在富士苹果发育前期为其骨架的形成提供碳水化合物，后期为花青苷的形成提供底物（宋哲等，，2009）。生产中，常常通过果实套袋的方式影响苹果果实的着色过程。果实摘袋后，
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S661.1
本文编号：2590157
【图文】：
图 1-1 植物中生长素的合成途径（Mashiguchi et al.，2011）Fig. 1-1 IAA Biosynthesis Pathway in Plants.2 生长素的运输长素的运输过程十分复杂，以极性运输为主，并且涉及到许多蛋白的精生长素的极性运输主要依赖于细胞内特异的运输载体实现。最早发现的入载体为 AUXI（AUXIN RESISTANTI），研究表明 AUX1 主要分布根，中柱细胞和源生韧皮部细胞，能够特异性的介导生长素由质膜外进入控根系发育（Bennett and Feldmann, 1996）。在 aux1 突变体中生长素的受到明显影响，根的向地性丧失；以自由扩散方式进入细胞内的外源 N复 aux1 突变体的表型，但需要主动运输的外源 2,4-D 无法恢复其表miro et al., 2001）。随后的研究表明与 AUXI 同源的 LAX1、LAX2 和 LAE AUXIN RESISTANT ） 同 样 具 有 生 长 素 输 入 载 体 的 功rtecheachirino et al., 2010）。
图 1-2 花青苷代谢途径（Petroni and Tonelli, 2011）Fig. 1-2 Anthocyanin metabolic pathways1.2.3 光照对花青苷的调控光照是花青苷合成过程中不可或缺的环境因子（Saure, 1990）。研究发现，苹果树冠内光照分布的不同对苹果果实花青苷的积累、果实含水量和可溶性固形物含量具有明显影响（张晶楠等，2010）。通过运用不同光质照射富士苹果，观察果实着色发现：UVB 光源照射富士苹果能够使果实含糖量和 PAL 酶活性显著增加，并且使果皮表面花青苷含量明显增加，促进了富士苹果的着色。分析显示，糖分的积累能够在富士苹果发育前期为其骨架的形成提供碳水化合物，后期为花青苷的形成提供底物（宋哲等，，2009）。生产中，常常通过果实套袋的方式影响苹果果实的着色过程。果实摘袋后，
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
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1 李睿;苹果多肽编码基因MdCEP1的克隆及功能鉴定[D];山东农业大学;2018年
本文编号：2590157
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