截短gRNA降低牛MSTN基因敲除脱靶效率的研究

发布时间：2020-03-20 00:26

【摘要】：肌肉生长抑制素(MSTN)又被称为GDF-8,是在1997年被发现的一种与骨骼肌生长发育相关的负调控因子,其活性的降低或丧失,会引起动物肌肉的过度发育,表现为双肌性状。CRISPR/Cas9技术是由gRNA指导Cas9内切酶特异性识别基因靶位点并且进行基因编辑的技术。CRISPR/Cas9技术拥有很多优势,但是也有脱靶的弊端。本实验所用的质粒CRISPR/Cas9-B,包含针对牛MSTN基因第二外显子而设计的gRNA,可以引导Cas9蛋白作用于AGAACCAGGAGAAGATGGACTGG位点。然而通过检索,我们发现除了牛2号染色体上的打靶位点,在4号染色体receptor-type tyrosine-protein phosphatase N2的5’端有17个碱基与gRNA匹配,1号染色体leukocyte immunoglobulin-like receptor的5’端有14个碱基与gRNA匹配,10号染色体kinectin isoform X7的5’端有16碱基与gRNA匹配,这些位点均为潜在脱靶点。为了检测脱靶效率,我们在这些位点两端分别设计引物用于PCR检测。为降低CRISPR/Cas9的脱靶效率,分别设计了截短1 bp、2 bp、3 bp和5 bp的gRNA,利用这些截短的gRNA构建CRISPR/Cas9质粒,分别命名为CRISPR/Cas9-19、CRISPR/Cas9-18、CRISPR/Cas9-17和CRISPR/Cas9-15。使用电转染的方法将这些质粒分别导入牛胎儿成纤维细胞中,利用流式细胞仪进行单细胞分离,并在96孔板内培养,以此获得基因敲除的细胞株。提取基因组,进行PCR扩增和电泳检测,将有目的条带的样品进行测序分析。最后比较截短1 bp、2 bp、3 bp、5 bp的g RNA所构建的CRISPR/Cas9质粒与CRISPR/Cas9-B质粒在打靶和脱靶位点的作用效率。结果显示,在MSTN打靶位点CRISPR/Cas-B、CRISPR/Cas9-19、CRISPR/Cas9-18、CRISPR/Cas9-17和CRISPR/Cas9-15引起基因突变的效率分别为62.16%、17.39%、7.69%、74.29%和3.85%;在4号染色体脱靶位点(2号引物)的作用效率分别为52.86%、0、0、8.82%和0;在1号染色体脱靶位点(9号引物)的效率分别为44.87%、51.72%、86.36%、0和50%;在10染色体脱靶位点(26号引物)的作用效率都为0。CRISPR/Cas9-17质粒在MSTN位点引起基因突变的效率比CRISPR/Cas9-B质粒的效率高,同时在三个脱靶位点的作用效率有明显降低,并且在统计学上有极显著差异(P0.01)。CRISPR/Cas9-17质粒达到了在不影响目的基因打靶效率的同时减小了脱靶现象的目的。本研究成功地在牛胎儿成纤维细胞敲除了牛MSTN基因,同时通过截短gRNA长度使CRISPR/Cas9技术的脱靶问题得以改善,使CRISPR/Cas9技术在牛羊育种领域能更好的发挥作用,为家畜和畜牧育种带来更大的机遇。
【图文】：

体系结构图,体系结构,核酸酶,靶向

图 1.1 Cas9 和 FokI-Cas9/gRNA 融合变体的体系结构[27]Figure 1.1 Architectures of Cas9 and FokI-Cas9/gRNA fusion variants[27]3.2 打破 PAM 的结构限制对 CRISPR/Cas9 打靶效率的优化FokI 核酸酶（RFNs）的切割依赖于二聚体 RNA（两个 gRNA）的引导，和方向上的严格限制，即需要两个 gRNA 共同定位。但是此复合体不仅仅是在的优势，，还包括所需要的有效基因组编辑活动。这些新核酸酶能够在人类细胞导基因组编辑。二聚体 RNA 引导 FokI 核酸酶（RFNs）识别扩展序列和高效率的内源性基因，并且可以通过敏感的深度测序方法判断，脱靶突变效率已经降的水平，但是符合 fCas9 复合物要求的靶位点数目有所减少。所以在设计引导体时，如果使用原有结构的 gRNA 会导致 CRISPR/Cas9 系统的靶向范围非常5’末端的 G 核苷酸的要求和 gRNA 对 5’-NGG 的 PAM 序列的要求限制了靶向可以改变 gRNA 和 dCas9 对 5’G 的需求，那么靶位点的范围将提高 16 倍[28]

示意图,质粒,原理,示意图

CRISPR/Cas9质粒Figure2.2CRISPR/Cas9vector
【学位授予单位】：内蒙古大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q78;S823

【参考文献】