茶树水杨酸羧基甲基转移酶（CsSAMT）基因的克隆及功能特性

发布时间：2020-03-19 23:35

【摘要】：水杨酸甲酯(MeSA)是广泛存在于食物、饮料和药剂中的一种特殊香料,它是一种有机酯类,可以释放花香类挥发性有机化合物(VOCs)。这些有机化合物存在于许多植物中,尤其是在冬青植物,在植物防御机制中饰演着重要的角色。茶是世界上最受欢迎的饮品之一,由于不同的茶树品种、萎凋时间和揉捻程度,不同茶类的香气有很大的区别。这些VOCs在茶叶中的含量虽然很少,但是对茶叶的香气和品质起着至关重要的作用。MeSA是赋予茶叶高品质的茶叶香气和滋味重要的化合物之一。前期研究表明,相对于其他茶类,白茶含有较高含量的MeSA。本文以白茶萎凋过程中香气化合物水杨酸甲酯的变化作为启发点,研究鉴定了茶树中催化MeSA合成的一个新的SAMT(水杨酸羧基甲基转移酶)基因CsSAMT。从茶树叶片cDNA中成功克隆、并使用大肠杆菌和酿酒酵母对CsSAMT酶活力进行验证,同时通过生物信息学分析、亚细胞定位、启动子克隆、DNA全长分析、荧光实时定量等对CsSAMT功能和表达特征进行研究。研究结果对茶叶香气的形成、优化和调控赋予了新的认识,对提高白茶的香气品质具有积极意义。主要研究结果如下:(1)通过SDE和GC-MS方法对白茶萎凋过程中MeSA含量进行检测,实验表明MeSA在白茶萎凋过程中随萎凋时间的延长呈现线性增长趋势。其中萎凋时间为6 h、12h、24 h和36 h时MeSA的含量逐步稳定上升,在72 h时,样品中MeSA的含量突然急剧增加是36 h茶叶样品的2.5倍。(2)通过RT-PCR方法从茶树叶片cDNA中克隆得到一段开放阅读框长度为1104 bp的序列,通过生物信息学比对后,命名为CsSAMT(GenBank:No.MG459470),该序列编码367个氨基酸,理论蛋白分子量和等电点为41297.38Da和5.224,GC含量为43.03%;系统发育树分析显示CsSAMT与其他植物SAMTs同源性在42% 100%之间,与山茶的SAMT同源性最高。经原核表达及真核表达后,对重组蛋白CsSAMT进行酶促反应,通过GC-MS进行产物检测表明CsSAMT能够催化水杨酸(SA)生成MeSA,且该蛋白具有较强的底物特异性。(3)运用Gateway方法构建含有加强型荧光报告基因(EGFP)重组载体CsSAMT,导入农杆菌,将其注射入烟草叶片中进行瞬时表达,通过激光共聚焦显微镜观察表明CsSAMT定位于叶绿体。(4)从茶树叶片基因组中克隆得到6342 bp的CsSAMT的DNA序列,经过分析发现该基因全长含有四个外显子区和三个内含子区,与已知的N-甲基转移酶基因家族的DNA序列结构相似。通过Genome walking方法克隆得到2012 bp的CsSAMT的启动子片段,通过PlantCARE在线软件分析后表明该DNA序列具有启动子的基本转录元件并含有一些特殊的顺式元件,影响并调节CsSAMT基因的转录。(5)CsSAMT荧光定量PCR分析表明该基因在幼嫩叶片中表达量较高,芽和第一叶的表达量大致相同,第二叶表达量最高,而茎和根中表达量较低(以老叶的表达量为对照)。第二叶的表达量约是芽和第一叶的1.5倍,约是茎和根的4倍和8倍。
【图文】：

示意图,苯类,部分合成,途径

的生物合成一直未被报道。根据已知的研究表明，水杨酸羧基甲基转移酶能够催化SA生成MeSA，这种甲基化反应由S-腺苷甲硫氨酸依赖的甲基转移酶催化产生。（如图2-1）近年来，植物中SAMTs基因逐渐被研究，但在茶树中的SAMT和白茶中MeSA的产生一直未被报道。为了验证茶树中CsSAMT基因在茶叶形成香气过程中的酶学特性，研究了白茶在萎凋处理过程中MeSA含量的变化，并将CsSAMT基因从茶树中克隆得到，对其进行酶活验证、生物学信息分析、亚细胞定位、启动子克隆、DNA全长分析、荧光实时定量等初步分析。本文中有关白茶香气形成的分子机制和相关基因的研究，将对茶叶香气的形成、优化和调节具有新的认识，，对提高茶叶尤其是白茶的品质具有重要意义。

示意图,水杨酸甲酯,白茶,部分合成

/苯丙素类化合物部分合成途径示意图。红色区域显示地为水杨酸合成水杨酸甲酯的生artial pathway for the biosynthesis of phenylpropanoid/benzenoids and the red box indicatebiosynthesis of methyl salicylic from salicylic acid路线验以白茶萎凋过程中特殊香气化合物水杨酸甲酯的生理变化（如点，研究鉴定茶树中一个新的 SAMT 基因 CsSAMT。
【学位授予单位】：安徽农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S571.1

【参考文献】