HSF4调控肝癌细胞系SMMC-7721中STAT1基因的表达

发布时间：2020-03-22 23:46

【摘要】：目的:STAT1保护宿主细胞免受病毒和其他病原体感染,在先天性免疫中起到重要作用。STAT1在肿瘤细胞中具有促凋亡和抗增殖活性,在细胞信号传导过程中起重要作用。然而STAT1在肝细胞癌中的调控机制知之甚少。为了研究stat1表达的调控机制,我们用生物信息学软件对stat1启动子区域结合的转录因子进行分析和预测,并进行验证,发现转录因子HSF4与STAT1表达具有相关性。SMMC-7721中hsf4的RNAi沉默升高STAT1 mRNA和蛋白质表达。通过ChIP-seq分析鉴定出STAT1基因的转录起始位点(TSS)上游254-489bp的启动子区域中的HSF4结合位点,预测的结合位点恰好在该区域内并且通过以下EMSA实验得到验证。当与HSF4共转染时,stat1的启动子活性通过荧光素酶报告基因测定来确定。在SMMC-7721中RNAi沉默HSF4后观察到细胞增殖减少和细胞凋亡增加。我们的研究结果将stat1鉴定为HSF4在SMMC-7721细胞系中的新转录靶标,从而为开发肝细胞癌治疗策略提供了基础。目前对stat1的研究,主要关注其本身的功能,stat1的表达调控机制尚未清楚,深入研究stat1有助于揭示肿瘤发生发展的机制,本实验拟从转录因子层面对stat1的调控机制进行研究。研究方法:(1)细胞培养人肝正常细胞系L-02、人肝癌细胞HepG2、SMMC-7721培养于DMEM培养液(含10%小牛血清),置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。(2)转录因子预测筛选用生物信息学软件JASPAR预测,可能与stat1启动子区结合的转录因子,对预测出的转录因子进行筛选,找出候选基因。(3)HSF4 siRNA干扰和建立高表达细胞系慢病毒方法,HSF4的siRNA干扰片段干扰SMMC-7721细胞系将HSF4全基因序列克隆到载体pEX-4中,形成pEX-4-HSF4表达质粒。(4)Real-time PCR检测mRNA表达Real-time PCR检测SMMC-7721细胞系HSF4和stat1的表达,及siRNA干扰和转染前后转录因子HSF4和启动子stat1的mRNA表达情况。(转染前后)(5)Western Blot Western Blot检测siRNA干扰和转染SMMC-7721细胞系前后,HSF4和STAT1的蛋白表达情况。(6)Ch IP-sequencing提取全基因组DNA进行ChIP-sequencing,获取SMMC-7721细胞系中与HSF4结合全基因组DNA。将Ch IP-seq提供HSF4结合区域,与JESPAR预测结果进行序列对比,找出stat1与HSF4结合位点。(7)荧光素酶报告基因将该荧光素酶报告基因质粒与hsf4基因表达质粒共转染到hek293细胞中,观察转染前后荧光素表达情况。(8)凋亡实验用PE-7AAD凋亡试剂/流式细胞仪检测HSF4干扰前后SMMC-7721细胞凋亡情况。(9)对实验数据进行统计学处理应用图像采集分析系统分析数据,所得数据用均数±标准差(±s)表示,应用统计软件,用单因素方差分析进行组间比较,P0.5为有统计学意义,P0.01为有显著统计学意义。结果:一.JASPER软件预测转录因子结合位点通过生物信息学软件JASPAR,预测出可以与stat1启动子区相结合的转录因子,从中筛选出转录因子HSF4。二、检测HSF4与stat1表达的相关性我们对HSF4和stat1进行Realtime PCR和Western Blot检测,发现在SMMC-7721细胞系中均表达趋势相反,提示HSF4与stat1表达具有相关性。三、siRNA干扰方法,检测HSF4对STAT1表达的调控作用siRNA干扰SMMC-7721细胞系的HSF4表达,Realtime PCR、Western Blot检测,发现stat1在SMMC-7721细胞系中表达升高,提示HSF4对STAT1表达有调控作用。四、Ch IP-sequencing通过生物信息学软件预测并确定转录因子为HSF4后,再进一步做HSF4的chip-s,并在启动子区找到了stat1结合位点。五、荧光素酶报告基因检测转录因子HSF4和其启动子STAT1中的特异顺序结合。通过敲除转录因子HSF4来检测启动子STAT1的变化活性。六、凋亡实验进步通过生物学实验,验证转录因子HSF4和启动子STAT1的调控关系。结论:初步证明,人肝癌细胞系SMMC-7721中,HSF4调控STAT1的表达,并找到HSF4与STAT1结合区域。
【图文】：

细胞系,反应检测,反转录,负相关

图 3.2 SMMC-7721 细胞系中 HSF4 与 STAT1 表达呈现负相关A：分别提取 L-02、SMMC-7721 细胞总 RNA，反转录后，并用相同质量数的 cDNA 作为模板进行 Real-time PCR 反应检测 hsf4 和 stat1 的 mRNA 表达情况。（p<0.05，n=6）B：分别在 L-02 和 SMMC-7721 细胞系中，HSF4 和 STAT1 的 Western Blot 检测结果, 以及Western Blot 灰度值检测结果3.3 HSF4 对 stat1 表达有负调控作用3.3.1 用 RNA 干扰技术干扰肿瘤细胞为了进一步验证 hsf4 对 stat1 基因表达的调控作用，我们采用 RNAi 方法干扰SMMC-7721 细胞系中 hsf4 基因的表达，观察其对 STAT1 的表达影响。结果显示，，HSF4 基因表达降低时，SMMC-7721 细胞系中 STAT1 的表达明显升高，图 3.3.1。

转染,慢病毒,细胞系,荧光显微镜

图 3.3.1 SMMC-7721 细胞系病毒转染后，HSF4 和 STAT1 的 mRNA 和蛋白的表达水平A：RNAi 干扰结果，通过慢病毒转染，荧光显微镜下可见绿色颗粒，证明慢病毒转染成功。B：Real-Time PCR 检测慢病毒转染前后 HSF4 的 RNA 表达 (P<0.05，n=3)，GAPDH 基因的mRNA 表达水平作为内参，显示 HSF4 表达降低。C：Real-Time PCR 检测干扰前后 STAT1 的 RNA 表达（p<0.05，n=3），图中数据为以 2-△△Ct的方法计算得到的来自三次相互独立的实验的平均值+-标准差的结果。D：Westernn Blot 检测干扰转录因子 HSF4 后，HSF4 和 STAT1 的蛋白表达。E：Westernn Blot 检测干扰转录因子 HSF4 后，HSF4 和 STAT1 的蛋白表达差异灰度值3.3.2 转染 HSF4 质粒检测转染前后 STAT1 和 HSF4 的表达量构建 HSF4 表达质粒，并将其转染到 SMMC-7721 细胞系中，并用 Real-time PCR和 Western Blot 检测转染前后 HSF4 和 STAT1 基因的表达情况。结果显示，HSF4表达升高，STAT1 的表达降低，二者有显著性差异，如图 3.3.2。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.7

【参考文献】