菊花DgWRKY5基因的耐盐性鉴定和转录组测序分析

发布时间：2020-03-24 07:58

【摘要】：菊花是我国十大传统名花和世界四大切花之一,观赏和经济价值极高。目前切花菊主要通过集约化设施进行连作栽培,设施中土壤次生盐渍化严重影响菊花生产和品质。因而培育耐盐菊花新品种已成为切花菊育种的一个重要目标。已有研究表明过量表达WRKY基因植株具有较强的抗盐性同时植株的表型无缺陷。因此本研究对DgWRKY5基因进行了分离和功能鉴定,同时对转DgWRKY5菊花和非转化菊花的差异基因进行筛选,可以为通过基因工程培育菊花抗盐优良又无表型缺陷的作物新品种提供了一条新途径,同时对DgWRKY5的抗盐机制进行了初步探讨。主要研究结果如下:1.用Real-time PCR方法检测了DgWRKY5在NaCl、ABA、GA和H_2O_2处理下的转录水平表达特性,以及在不同组织中的表达量。结果表明DgWRKY5表达在各种胁迫下均被诱导;且与其他组织相比,在叶片中观察到更高的DgWRKY5表达量。2.选取了过表达DgWRKY5菊花的OE-17和OE-56株系和野生型菊花进行NaCl处理开展抗盐性鉴定。研究结果表明,盐胁迫下,转基因菊花的叶片未出现明显的枯萎和泛黄,同时转DgWRKY5菊花OE-17和OE-56的存活率显著高于野生型(P0.05)。盐胁迫下,转DgWRKY5菊花的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性显著高于野生型;同时二氧化氢(H_2O_2)、氧离子(O_2~-)和丙二醛(MDA)在转基因菊花中的含量降低了,且DAB和NBT染色也比野生型浅。盐胁迫下转DgWRKY5菊花的根长、鲜重、叶绿素含量和叶片气体交换参数等数据均优于野生型。3.通过qRT-PCR测定了8个胁迫相关基因的相对表达量,初步探讨DgWRKY5对盐胁迫的分子调控机制。在转DgWRKY5菊花中胁迫相关基因DgAPX,DgCAT,DgNCED3A,DgNCED3B,DgCuZnSOD,DgP5CS,DgCSD1和DgCSD2的表达上调,从而提高了转基因菊花的耐盐性。4.运用Illumina HiSeq对转DgWRKY5菊花和野生型菊花进行转录组测序,共产生309068个长度大于200bp的转录本以及拼接成功153887个Unigene,总数据量14.26G。两者共有1078个差异基因(qvalue0.005和|log2(foldchange)|≥1),其中上调基因593个,下调基因485个。通过差异基因KEGG代谢通路分析,与非生物胁迫相关的上调代谢通路有:谷胱甘肽代谢、类胡萝卜素生物合成、植物激素信号转导、精氨酸和脯氨酸代谢等。用qRT-PCR对8个差异基因进行基因表达水平验证。以上研究结果表明,本次研究的转DgWRKY5菊花比野生型菊花更具耐盐性,且DgWRKY5基因能通过增加渗透调节物质的含量,调节活性氧清除酶的含量,提高叶片光合作用以及调节相关胁迫应答基因的表达等来增强菊花的耐盐性。
【图文】：

转录物,盐处理,菊花

然后下降（图 2-c）。H2O2在处理 12 小时后诱导了 DgWRKY5 的表达，随后逐渐下降（图 2-d）。而在 GA 处理期间，DgWRKY5 转录物逐渐积累，在 3 小时达到最大值并逐渐减少（图 2-e）。这些结果表明 DgWRKY5 基因的表达在各种胁迫（NaCL,ABA, H2O2和 GA）下被诱导。

转基因,菊花,耐盐性,过表达

2.3.2 转 DgWRKY5 菊花的耐盐性分析为了研究DgWRKY5的过表达是否增强了菊花的耐盐性，培育了过量表达DgWRKY5的转基因菊花株系，并且通过qRT-PCR检测了8个转基因系中的DgWRKY5的转录水平。如图 3-a 所示，OE-17 和 OE-56 的 DgWRKY5 转录水平显著（P <0.05）高于野生型，分别为野生型菊花的 3.5 和 2.6 倍。因此选择 OE-17 和 OE-56 株系菊花进行下一步的耐盐性评估。在正常条件下，转基因菊花和野生型菊花的表型没有显著差异，而在盐胁迫下，与转基因株系 OE-17 和 OE-56 相比，野生型植株的叶片有明显的枯萎和泛黄，特别是在盐胁迫的 10-15 天（图 3-c，d）。在盐胁迫后进行两周的恢复期，，仅有 35%的野生型存活，而 OE-17 株系有 88%的植株存活，OE-56 株系也有 78％的存活率，均超出了野生型一倍多（图 3-b）。因此，对盐胁迫下菊花的生理表型和存活率而言，转基因株系比野生型植株显示出了更强的盐度耐受性。
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S682.11

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