Vps4b在基因敲除小鼠牙胚发育中的时空表达及作用研究

发布时间：2020-03-24 15:23

【摘要】：背景与目的细胞液泡蛋白质分选因子4 B(Vacuolar protein sorting 4B,VPS4B)是AAA ATP酶家族成员之一,在细胞内蛋白质运输、溶酶体降解、病毒体出芽以及调节有丝分裂等过程中发挥着重要的作用。本课题组此前对一个牙本质发育不良I型(Dentin dysplasia type I,DD-I)家系进行外周血基因测序发现其致病基因为VPS4B,其次通过体外细胞实验初步阐述VPS4B基因通过Wnt通路调控牙齿的发育过程。为阐明该基因在牙齿发育过程中的详细作用机制,构建Vps4b基因敲除小鼠展开进一步的研究。本实验运用已成功构建的Vps4b基因敲除小鼠模型,明确Vps4b基因在牙胚发育过程中的分布情况,并探讨该基因突变对牙齿发育相关基因的影响,进一步揭示该基因在牙齿致畸中的作用机制。材料与方法以CRISPR-Cas9技术构建的Vps4b基因敲除小鼠模型为研究对象,采用定点交配的方式合笼,记录怀孕时间。分别于怀孕13.5、14.5、16.5天断颈处死孕鼠取胎鼠头部及尾巴;于出生后2.5天和7天处死新生小鼠取下颌骨和尾巴。采用PCR技术鉴定胎鼠及新生幼鼠的基因型。将胎鼠头部及幼鼠下颌骨石蜡包埋后获取下颌第一磨牙牙胚组织切片,通过HE染色确定各组牙胚的发育时期,免疫组织化学方法分别检测不同发育时期的正常小鼠下颌第一磨牙牙胚中Vps4b、Dspp和Col-I的表达分布情况,并对比Vps4b基因敲除后小鼠牙胚中Vps4b、Dspp和Col-I的表达变化。结果PCR结果显示子代小鼠基因型为Vps4b~(+/+)和Vps4b~(+/-)两种。HE染色表明胚胎13.5、14.5、16.5天的小鼠下颌第一磨牙牙胚分别发育至蕾状期、帽状期和钟状期,出生后2.5天、7天牙胚处于分泌期和矿化期。正常小鼠免疫组织化学染色显示:蕾状期和帽状期时,Vps4b在牙胚中广泛表达,Dspp和Col-I均无表达;钟状期Vps4b表达于内、外釉上皮、牙乳头和牙囊,Dspp在内釉上皮和牙乳头中表达,Col-I表达于牙乳头和牙囊;分泌期和矿化期Vps4b、Dspp和Col-I在成釉细胞、成牙本质细胞和牙囊中均有表达,牙乳头亦可见Vps4b和Col-I的阳性表达。小鼠基因突变后Vps4b在蕾状期成釉器中变为阴性表达,在一些组织中表达强度变弱(P0.05);Dspp在钟状期的牙乳头和分泌期的牙囊中均未见表达,在分泌期的成釉细胞、成牙本质细胞和矿化期牙囊中阳性细胞数减少(P0.05);Col-I在钟状期、分泌期和矿化期的表达部位均无变化,仅在部分组织表达强度下降(P0.05)。结论在Vps4b~(+/+)小鼠发育过程中Vps4b表达于不同阶段的牙胚中且随着发育的进行表达强度发生改变,说明Vps4b可能参与了牙胚的正常发育。在Vps4b~(+/-)小鼠发育过程中Vps4b表达强度减弱,且牙齿发育相关蛋白的表达下降,推测其可能通过调节自身及牙齿发育相关蛋白的表达进而影响牙齿的发育。
【图文】：

小鼠Vps4bgDNA扩增结果图：A.以F1/R1为引物扩增出2种条带；B.以F1/R2

钟状期,帽状期,蕾状期,牙胚

牙齿形态发生的功能[43]。（图 4.2B）胚胎 16.5 天，，成釉器继续生长，内釉上皮层向成釉器方向凹陷更深，其周围细胞继续向间充质生长，形如吊钟，称钟状期成釉器。在钟状期，成釉器包括四层细胞，即在帽状期成釉器的基础上在内釉上皮层和星网状层之间增加了中间层，此外内釉上皮和外釉上皮交界处形成颈环结构，牙胚失去与口腔上皮的联系。此期牙齿形态已基本确定，随着发育的继续进行内釉上皮细胞和紧邻的牙乳头细胞发生相互诱导，分别分化为成釉细胞和成牙本质细胞。（图 4.2C）出生后第 2.5 天，牙冠的未来形状已确定，外釉上皮细胞逐渐退化，内釉上皮细胞完全分化为高柱状的成釉细胞并分泌有机基质，邻近的牙乳头细胞分化成成牙本质细胞不断分泌有机基质，继而发生矿化。因此期分泌大量的有机基质，因而被称为分泌期，牙釉质和牙本质是有规律的交叉形成的。内釉上皮和外釉上皮在颈环部位增生，向未来根尖孔的方向生长，形成赫特维希上皮根鞘。（图 4.2D）出生后第 7 天，牙冠发育即将完成，由成釉细胞和成牙本质细胞分泌的基质蛋白已矿化，可见一定厚度的牙釉质和牙本质形成。（图 4.2 E、F）
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R78

【参考文献】