马铃薯泛素化蛋白质组学分析及StPUB27基因功能研究

发布时间：2020-03-25 03:44

【摘要】：泛素-蛋白酶体系统是细胞内高度特异性的蛋白质降解方式,也是一种重要的蛋白质翻译后修饰。泛素化修饰参与植物非生物胁迫响应、细胞信号转导等众多生理过程。干旱胁迫是影响马铃薯生长发育和产量的主要因素之一,提高马铃薯的抗旱能力是目前马铃薯遗传改良的重要任务。本研究对马铃薯泛素化修饰蛋白进行了高通量筛选,并对U-box泛素连接酶基因家族和StPUB27参与干旱胁迫的机制进行了系统研究,主要方法和结果如下:1.对马铃薯进行渗透胁迫,用qRT-PCR技术检测泛素(Ub)和26S蛋白酶体(26S)基因相对表达量;并用K-ε-GG抗体对胰蛋白酶水解后的马铃薯总蛋白进行泛素化修饰肽段富集,用LC-MS/MS技术对泛素化修饰肽段进行鉴定,然后用生物信息学技术进行分析。结果表明,渗透胁迫下马铃薯26S基因表达量上升,泛素化水平提高;LC-MS/MS分析共检测到泛素化修饰位点314个,分布在200个修饰蛋白上;其中差异修饰位点25个,包括3个显著下调和22个显著上调。2.对干旱胁迫下马铃薯进行RNA-seq分析,从中筛选常用内参基因进一步分析干旱胁迫、渗透胁迫和自主设计的模拟干旱胁迫下最稳定的内参基因。结果表明:干旱胁迫和模拟干旱胁迫下最适合的内参基因是EF1α,渗透胁迫下最适合的内参基因是sec3,并且EF1α和sec3在三种处理下均表现出最佳的表达稳定性。3.利用U-box保守序列构建本地隐马尔科夫模型,然后对马铃薯基因组数据库进行检索,同时利用拟南芥和水稻已经鉴定的U-box基因进行BLAST搜索,对得到的马铃薯U-box家族成员进行特征分析。结果共检索到马铃薯U-box基因66个,其中23个含有ARM结构域;66个StPUB基因分布在10条染色体上,且基因结构差异明显,有37个StPUB基因的外显子在2个以上,同时也有29个基因是连续基因;进化关系分析发现大多数St PUB基因与物种内U-box基因遗传距离比物种间更接近,并且铃薯U-box家族基因中存在大量旁系特异性扩张的基因,它们具有高度同源性,且往往串联分布在染色体上。4.从马铃薯栽培品种“Atlantic”和“青薯9号”中分别克隆得到StPUB27,并进行序列比对和结构分析。结果发现不同品种中StPUB27基因CDS全长均为2049 bp;序列比对发现“Atlantic”、“青薯9号”与测序二倍体材料“DM1-3(Solanum phureja)”的StPUB27基因CDS区和氨基酸均高度保守,同源性分别为97.66%和96.33%。进化树分析发现StPUB27基因与野生番茄(Solanum pennellii)和番茄(Solanum lycopersicum)中同源基因的亲缘关系最近;信号肽分析发现StPUB27蛋白不含信号肽,不属于分泌蛋白。亚细胞定位预测发现StPUB27蛋白最可能在线粒体发挥生物学功能,属于核编码的线粒体蛋白。分析StPUB27基因启动元件发现在上游1000 bp序列中存在多个响应非生物胁迫的顺式作用元件和激素应答顺式作用元件,如CCAAT-box、MRE和CGTCA-motif。以plakophilin 1为模板进行空间结构同源建模,最终预测到“Atlantic”和“青薯9号”StPUB27空间三维结构高度相似。5.构建了强组成型启动子CaMV 35S驱动的St PUB27基因的过表达载体CaMV35S-pCPB-StPUB27和RNAi载体pHellsgate8-stpub27,转化马铃薯并进一步分析StPUB27基因的功能。结果表明St PUB27基因过表达能够加快转基因植株离体叶片失水,过表达植株的叶片拥有更大的气孔导度,但其脯氨酸含量并未显著变化,这预示着StPUB27基因并不参与泛素化降解途径,更有可能参与泛素化修饰调节靶蛋白的活性。综上所述,本研究表明泛素-蛋白酶体系统与马铃薯干旱响应密切相关,马铃薯U-box泛素连接酶基因家族含有66个成员,StPUB27基因参与马铃薯气孔调节并负调控马铃薯干旱耐受性;另外,EF1α和sec3基因是干旱胁迫、渗透胁迫和模拟干旱胁迫下最稳定的内参基因。
【图文】：

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图 1.1 泛素-蛋白酶体系统示意图[59-61]Figure 1.1 Ubiquitin and the ubiquitin proteasome system[59-61]A：泛素级联反应的过程；B：泛素化修饰的类型；C：U-box 泛素连接酶直接将 Ub 转移到靶蛋白上。A: Ubiquitination pathway. B: Possible arrangement of ubiquitin modifications on the targprotein. C: Substrate ubiquitination directly transfer Ub from E2 to the substrate by U-box ligase.

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图 1.2 泛素化修饰蛋白富集和分析原理[127]Figure 1.2 Ubiquitin-modified protein enrichment and analysis[127]1.5 本研究的目的和意义干旱胁迫是影响马铃薯生长发育和产量的主要非生物胁迫之一，，提高马铃薯
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S532

【参考文献】