中华鳖figla基因的克隆及其在性腺中的表达分析

发布时间：2020-03-25 03:32

【摘要】：figla(factor in the germline alpha)是bHLH(basic helix-loop-helix,碱性螺旋-环-螺旋)家族的一员,在动物的生殖发育调控过程中起着极为重要的作用,特别是在大部分脊椎动物的卵泡形成及卵巢发育中起着重要的调控作用。figla基因具有高度保守的bHLH结构域,已在部分脊椎动物中得到鉴定与分析。中华鳖(Pelodiscus sinensis)是爬行类动物中较为普遍的种类,因其具有极高的药用和营养价值,导致其资源的过度开发利用及环境的恶化,致使中华鳖种质退化严重。因此利用传统选育与现代细胞、基因工程等育种技术相结合的新方法进行良种培育已变得至关重要。生殖细胞是育种新技术研究的细胞基础,中华鳖生殖细胞发育分化的研究是进一步了解其生殖发育调控机制的前提。本论文以中华鳖为实验模型,对figla基因在其生殖细胞发育中的表达模式进行了初步分析,详细的工作内容如下:1.中华鳖figla基因的克隆及分析本研究克隆并分析了中华鳖figla基因的部分cDNA序列,该序列长度为714bp,其中包含完整开放阅读框642 bp,3’端非编码区72 bp;共编码213个氨基酸,包含一个高度保守的bHLH结构域。Figla氨基酸序列比对结果显示,其蛋白序列与西部锦龟同源性最高,达93%;此外,NJ系统进化树的分析结果显示,中华鳖Figla蛋白与哺乳类、鸟类的聚为一支。2.中华鳖figla的组织特异性分析半定量PCR和荧光定量PCR(qRT-PCR)结果表明:中华鳖figla基因mRNA主要在卵巢和精巢中表达,其中在卵巢中表达较强,精巢中表达较弱,而在其它体组织中几乎不表达。3.中华鳖figla mRNA在卵巢中的表达分布情况由中华鳖卵巢组织的化学和荧光原位杂交结果可知:中华鳖figlamRNA在卵子发生过程中的各期卵泡中均有信号,其中在初级卵母细胞(Ⅱ-Ⅴ期)中的信号最强,且主要定位在卵母细胞胞质中;在生长期卵母细胞(Ⅵ-Ⅸ期)发育至成熟卵母细胞(Ⅹ期)的过程中,figlamRNA分布在卵母细胞胞质及其外周的滤泡细胞中,且在卵母细胞胞质中的信号逐渐减弱,在滤泡细胞中的信号逐渐增强。研究结果表明figla基因可能主要调控中华鳖卵泡形成及卵巢的发育。4.中华鳖figla mRNA在精巢中的表达分布情况中华鳖figla mRNA在精子发生中各时期的细胞中表现出动态的变化。中华鳖figlamRNA在精母细胞和精子细胞中的信号较强,在精原细胞中的信号较弱,在体细胞中几乎检测不到信号。研究结果表明figla基因可能在精母细胞和精子细胞发育过程中也起到一定的调控作用。综上所述,figla基因可作为中华鳖卵泡和卵母细胞发育的关键基因,参与调控卵泡的形成及卵巢发育,同时可能在中华鳖精子发生过程中也起到一定的调控作用。本研究为进一步开展中华鳖及其它爬行动物的配子生成、性腺发育与分化等研究奠定了基础。
【图文】：

氨基酸序列,中华鳖,核苷酸序列,氨基酸序列

15图 1-1 中华鳖 figlɑ cDNA 的核苷酸序列和氨基酸序列起始密码子（ATG）和终止密码子（TAA）用黑体加粗所示；bHLH 保守功能域用灰色阴影所示。Fig. 1-1 Nucleotide and proteins sequences of Pelodiscus sinensis figlɑ cDNAThe translation start codon ATG, stop codon TAA are shown in bold; bHLH conserved domain arehighlighted with grey shadow.

氨基酸序列,进化树,银鲑,非洲爪蟾

图 1-3 NJ 法构建系统进化树线的长度与遗传距离成正比，中华鳖用“●”表示。构建系统树所用各脊椎动物的 Figla 氨基酸序列如下：西部锦龟（Chrysemys picta bellii，XP_005285304.1），非洲爪蟾（Xenopus tropicalis，CAJ82168.1），安乐蜥（Anolis carolinensis，XP_008120436.1），家鼠（Mus musculus，NP_036143.1），人（Homo sapiens，NP_001004311.2），牛（Bos taurus，NP_001268849），普通珠鸡 (Numida meleagris ， XP_021230749.1 ），蓝冠娇瀇（ Lepidothrix coronata ，XP_017692764.1），斑马鱼（Danio rerio，NP_944601.2），，银鲑（Oncorhynchus kisutch，XP_020344386），青溕（Oryzias latipes，NP_001098215.1），红鳍东方渶（Takifugu rubripes，NP_001177290 ），半滑舌鳎（ Cynoglossus semilaevis ， XM_017042726 ），多棘雀鲷（Acanthochromis polyacanthus，XP_022074641.1），尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus，AJP62204.1）。Fig.1-3 Phylogenetic tree established by the neighbor-joining methodThe size of the phylogenetic tree is in propotion to the genetic distance, and the Figla of Pelodiscussinensis is highlighted by the black dot. The amino acid sequences used in this study are as follows:
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S917.4

【参考文献】