华癸中慢生根瘤菌谷胱甘肽合成酶基因gshB的功能研究

发布时间：2020-03-24 21:54

【摘要】：谷胱甘肽(Glutathione,GSH)是广泛存在于细胞中的一种活性巯基短肽。谷胱甘肽对于维持细胞正常的氧化还原环境具有重要作用。谷胱甘肽是由γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(gshA编码)和谷胱甘肽合成酶(gshB编码)两个酶催化合成的。华癸中慢生根瘤菌(Mesorhizobium huakuii)是一种能够与豆科植物紫云英建立共生关系的革兰氏阴性细菌,它能通过与宿主植物形成的根瘤来固定大气中的N_2,从而转换成氨,为植物的生长提供所需的氮源,同时宿主植物也将为根瘤菌的固氮过程提供一定的能量。通过生物信息分析,在华癸中慢生根瘤菌7653R中发现了谷胱甘肽合成酶基因gshB(MCHK_5809)。本研究通过构建华癸中慢生根瘤菌谷胱甘肽合成酶gshB基因的突变体,来研究gshB基因在根瘤菌自由生长、抗氧化和共生固氮中的功能。通过生长和氧化物抑菌实验,研究了gshB在华癸中慢生根瘤菌7653R生长和氧化应急状态下的功能。gshB突变体MHgshB不能有效地利用蔗糖、果糖、麦芽糖、葡萄糖、甘露醇等化合物作为唯一碳源生长。同时对于谷氨酸、谷氨基酸、还原型谷胱甘肽、半胱氨酸、天冬氨酸、丙氨酸等多种氨基酸的利用效率也显著降低,表明谷胱甘肽是有效转运碳源和氨基酸所必需的物质。MHgshB在无机氧化物过氧化氢(H_2O_2)和有机氧化物叔丁基过氧化氢(t-BHP)胁迫下敏感,但是对于有机氧化物过氧化氢异丙苯(CuOOH)的氧化胁迫没有影响。因此,谷胱甘肽在某些抗氧化胁迫中有着重要的作用。通过华癸中慢生根瘤菌与紫云英的盆栽实验,研究了gshB基因在共生固氮中的功能。虽然gshB突变体形成的是红色根瘤,并且其结瘤数量与野生型相比没有差异,但是其固氮量减少了70%。根瘤切片和电镜结果表明:gshB突变株形成的根瘤含有少量正常类菌体以及大量正在衰亡的类菌体,表明谷胱甘肽在根瘤菌与紫云英共生固氮以及防止根瘤早衰方面有重要作用。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)实验,研究了相关基因在H_2O_2胁迫下和共生条件下的表达量。结果表明,支链氨基酸转运系统相关基因braE、braG,氨基酸通透酶基因aapJ、aapQ的表达量不仅没有降低反而有所增加。表明谷胱甘肽不是通过调控Bra和Aap转运系统的转录水平来影响氨基酸运输。过氧化氢-过氧化物酶基因katG表达量显著上调,而与电子传递相关的调控基因Hmus、RhtA的表达量没有显著变化,表明谷胱甘肽的缺失会启动机体内其他抗氧化机制发挥应急反应,从而导致其它抗氧化基因表达量增加。此外,根瘤固氮基因nifH、nifD表达量都显著下调,表明谷胱甘肽缺失会降低固氮基因的表达,从而导致根瘤固氮活性降低。
【图文】：

氧化伤害,酶促

图 1.1 ROS 引起的氧化伤害（引自 SimonV,2010）Figure1.1The damage caused by ROS(from SimonV,2010)体内活性氧的清除机制OS 水平超过自身的承受能力时就会对细胞造成氧化损伤，生物列复杂的抗氧化机制用以维持 ROS 的稳态[13]。在细胞内存在的包括：过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）、超SOD）、谷氧还蛋白系统（Glutaredoxin system）、硫氧还蛋白系 system）等，以及非酶促抗氧化体系包括：谷胱甘肽、硫氧还原（Ve）、β-胡萝卜素和黄酮类物质、多酚类以及抗坏血酸（ASC）分非酶类的抗氧化剂机体不能自己合成需要从食物中获得，从而体系中非酶促抗氧化体系所占的比例不大[15]。见的非酶促抗氧化

代谢机制,谷胱甘肽

有一些植物比如：豆科类的植物并不会受到外界环境变化的影响，这植物体内抵抗外界环境变化带来的氧化胁迫的过程中具有不可替代的谷胱甘肽胱甘肽是一种特殊的氨基酸衍生物，它的活性位点为于半胱氨酸的菌中谷胱甘肽的生物合成是由 ATP 相关酶催化完成的两步过程。首胺酰半胱氨酸合成酶的作用下 L-谷氨酸、L-半胱氨酸合成 γ-谷胺酰然后，甘氨酸与 γ-谷胺酰半胱氨酸在谷胱甘肽合成酶的作用下合成谷正常条件下，，谷胱甘肽在细胞中有还原型（GSH）和氧化型（GSSG，并且在谷胱甘肽还原酶（GR）和谷胱甘肽氧化酶（GPx）的作用（图 1.2）。一般情况下，在生物体内发挥抗氧化作用的是还原型谷可以保护机体免受外界环境的伤害[18-19]。
【学位授予单位】：中南民族大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q939.114

【参考文献】