百合甘油-3-磷酸酰基转移酶基因结构预测及启动子活性研究

发布时间：2020-03-25 07:52

【摘要】：植物基因工程研究中的一项重要且前沿的课题是基因的表达和调控,而启动子及其顺式作用元件在转录水平上的调控起重要作用,已经成为分子生物学研究的热点。诱导型启动子能在受到胁迫时诱导启动基因的表达,降低自身的伤害,避免能量浪费。百合具有食用、药用和观赏价值,但百合易受病害、不良环境影响,而利用诱导型启动子的结构和功能特性可以提高百合等植物抗逆性。本研究基于课题组成果积累,选取岷江百合和毛百合作为试验材料,利用生物信息学分析对两种百合GPAT基因进行序列分析,利用荧光定量PCR技术分析基因表达量,利用基因克隆技术,克隆两种百合GPAT基因启动子的缺失片段并进行烟草转化,主要结果如下:1.将毛百合LpGPAT和岷江百合LrGPAT进行同源比对,同源性为96.34%。通过对拟南芥ATS1蛋白、多种其它GPAT蛋白和两种百合GPAT蛋白保守结构域查找和比较发现,两种百合GPAT蛋白和其它植物GPAT蛋白同样具有保守性强的酰基转移酶活性结构域:motifsI,II,III和IV,该结构域在利用在线软件SMART分析两种百合GPAT的结构域的范围内,即毛百合和岷江百合GPAT氨基酸序列在176-322位和169-315位有一个PlsC酰基转移酶结构域,说明GPAT蛋白属于酰基转移酶家族成员,具有酰基转移酶的活性。利用在线软件TMHMM Server 2.0对两种百合GPAT结构域序列进行预测,结果表明两种百合GPAT结构域可能具有疏水性且不含跨膜区。利用在线软件SignalIP 4.0对两种百合GPAT结构域序列的信号肽区域进行预测,结果表明两种百合的GPAT结构域序列可能都没有信号肽。对两种百合GPAT基因启动子序列利用NewPLACE、PlantCARE等分析预测网站分析,结果发现在序列中包含许多的TATA-box、CAAT-box等核心顺式元件,另外还有许多与逆境胁迫相关的顺式作用元件:MYC、TC-rich repeats、MYB、ABRE、MBS和DRE等。2.利用实时荧光定量PCR技术研究两种百合GPAT基因表达量,发现通过ABA诱导后,两种百合GPAT基因表达量均呈升高趋势,其中岷江百合表达量升高更加明显。3.根据序列分析结果,将LpGPAT全长启动子序列从5’端截短成1466 bp、884 bp、566bp、412bp的不同长度序列,分别命名为GPAT F1、GPAT F2、GPAT F3、GPAT F4,用以替换植物表达载体PCAMBIA1303上的35S启动子。4.利用农杆菌介导的叶片注射法进行烟草转化,通过缺失分析结合GUS组织化学染色揭示了LpGPAT启动子844 bp和LrGPAT启动子384 bp的片段可以驱动GUS在烟草中的诱导性表达。因此,猜测384 bp的片段是最小的具有活性的GPAT基因启动子。
【图文】：

分析图,百合,结构域,疏水性

图 2-2 SMART 预测 GPAT 结构域序列比对Fig. 2-2 SMART predicted GPAT Domain Sequence Alignment2.2.2 两种百合 GPAT 蛋白的疏水性和跨膜分析图 2-3 中纵轴表示亲水指数，横轴表示氨基酸位置，指数为正表示疏水，指数为负表示亲水，正数越大表示越疏水。两种百合 GPAT 结构域（A 为毛百合 LpGPAT，，B为岷江百合 LrGPAT）的疏水性分析结果显示：最大的疏水峰值分别为岷江百合-2.744、毛百合-2.744 最大的亲水峰值分别为岷江百合 2.289、毛百合 2.189。疏水氨基酸残基79 个明显多于 67 个亲水氨基酸，符合结构域亲疏水性特征，两种百合 GPAT 结构域的疏水性分析中只有其中 140 位置出现亲水性数值大小差异，但是不存在亲疏水性差异，推测结构域功能相差不大。A B

百合,信号肽,叶绿体,氨基酸组成

图 2-4 Tmpred 预测两种百合 GPAT 跨膜区Fig.2-4 Prediction of transmembrane helices in 2 kinds of Liliums GPAT2.2.3 两种百合 GPAT 蛋白的信号肽分析预测信号肽的基本组成是一般由 5 个带正电的氨基酸组成的 N 端、一个由疏水氨基酸组成的疏水 H 区和有更多极性氨基酸分布的更强极性的 C 区，如下图所示：根据预测结果分析这两个蛋白可能没有信号肽（A 为 LpGPAT，B 为 LrGPAT），但目前的研究显示对抗寒起作用的 GPAT 定位于叶绿体，而我们对这两种百合 GPAT的定位预测也是在叶绿体上，猜测其在叶绿体外膜上起作用。A B
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q943.2

【参考文献】