肝郁证雌性大鼠乳腺的癌前基因表达及柴胡疏肝散的干预作用

发布时间：2020-03-25 08:25

【摘要】：目的:现代医学认为乳腺增生与癌变之间存在一定的关联,肝郁证是乳腺增生性疾病重要的中医证型之一。临床和实验显示,疏肝解郁方-柴胡疏肝散防治乳腺增生性疾病有一定的疗效。本文提出肝郁、乳腺增生与乳腺癌变之间可能存在某种的关联的推测,拟在束缚肝郁证雌鼠模型复制的基础上,观察该模型大鼠性腺轴以及乳腺的变化,在分子层面上探查了其乳腺增生及其相关癌前基因的表达;进一步基于方证相关原理,观察了因证治方柴胡疏肝散对该模型雌鼠肝郁证候和性腺轴的影响及对乳腺增生的防治作用机制。论文包括文献综述和实验研究两个部分。文献综述主要围绕中医对乳腺增生症的防治和乳腺增生与乳腺癌之间的关系进行了相关文献的搜集与整理。实验研究探查了束缚肝郁模型雌鼠中医证候、乳腺增生及其癌前病变的分子机制及柴胡疏肝散的相关作用。方法:大鼠随机分为正常对照组、肝郁模型组(以下简称模型组)、柴胡疏肝散大剂量组(柴大组)、柴胡疏肝散小剂量组(柴小组)。除正常组外,其余三组按慢性束缚应激法连续造模4周。造模第2周末,柴大组和柴小组分别按相当于药材1.24g/kg、0.31g/kg的剂量(相当于成人用量的2倍和0.5倍)给予柴胡疏肝散灌胃,每日1次,连续2周;正常组和模型组给予等量的蒸馏水。于造模第27天制备各组大鼠阴道涂片观察动情周期情况,选择动情前期/动情间期(实验第28-30d)进行麻醉处杀,经腹主动脉取血,分离血清和血浆;低温下取下丘脑和乳腺组织,待测。观测指标:(1)肝郁证相关外观行为指标:1)造模期间观察并记录各组大鼠每周外观行为和体重的变化,于2周末和4周末做糖水偏嗜试验,4周末做旷场试验;2)肝郁证相关实验室指标:下丘脑促肾上腺皮质激素释放激素(CRH)、血清促肾上腺皮质激素(ACTH)、皮质酮/肾上腺酮(CORT)、血浆5-羟色胺(5-HT)、多巴胺(DA)、肾上腺素(E)、去甲肾上腺素(NE);(2)性激素及其调节轴指标:下丘脑促性腺激素释放激素(GnRH)、血清促卵泡刺激素(FSH)、促黄体生成素(LH)、泌乳素(PRL)、孕酮(P)、睾酮(T)、雌二醇(E2);(3)乳腺器官:乳腺病理组织学观察;(4)癌前基因指标:血清三叶因子1(TFF1)、三叶因子3(TFF3),乳腺基质金属蛋白酶抑制因子2(TIMP-2)、存活素(Survivin);(5)PRL介导的信号通路相关指标:泌乳素受体(PRLR)、AKT、BAD、Bcl-2、MDM2、P53。数据处理:所得数据均以x±S表示,采用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行检验后,多组间比较采用Student Newman Keuls Test检验。全部数据采用SPSS 20.0 for windows软件统计处理。所有图表均用GraphPad Prism 7软件制作。结果:(1)肝郁证相关指标:1)一般外观行为学的变化:与正常组相比,模型组大鼠第2周～第4周各组行为评分明显升高(p0.01),体重明显降低(p0.01);第2周糖水偏嗜度明显升高(p0.01),第4周糖水偏嗜度明显降低(p0.01);第4周旷场试验中央区停留时间、爬格数、爬格里程数均明显降低(p0.01)。与模型组比较,柴大组大鼠第3～4周各组行为评分明显降低(p0.01),第4周体重明显增加(p0.01);柴大组大鼠第4周糖水偏嗜度明显升高(p0.01),旷场试验中央区停留时间、爬格数、爬格里程数明显升高(p0.01);柴小组大鼠上述指标未见明显变化。2)实验室指标的变化:与正常组比较,模型组大鼠下丘脑CRH、血中ACTH、CORT、E表达明显升高(p0.01 或p0.05)、血中 5-HT、NE、DA 含量明显降低(p0.01 或p0.05)。与模型组比较,柴大组大鼠下丘脑CRH、血中ACTH和CORT表达明显降低(p0.01或p0.05)、血中5-HT、NE含量明显升高(p0.01或p0.05),柴小组大鼠血中CORT表达降低(p0.05),NE、DA表达明显升高(p0.01);与柴大组比较,柴小组大鼠下丘脑CRH、血中DA表达明显升高(p0.01或p0.05)、血中5-HT明显降低(p0.01)。(2)性激素及其调节激素的变化:与正常组比较,模型组大鼠下丘脑GnRH、血清FSH、LH、PRL、T、E2、P表达明显升高(p0.01)。与模型组比较,柴大组大鼠下丘脑GnRH,血清LH、PRL、T、P表达明显降低(p0.01或p0.05),柴小组血清LH、PRL、T、E2表达明显降低(p0.01或p0.05)。与柴大组比较,柴小组下丘脑GnRH表达明显升高(p0.01);E2/P的比值在四组间均无明显差异(p0.05)。(3)乳腺器官的变化:镜下观察到正常组大鼠乳腺腺泡形状规则,腺导管管腔无扩张,腺泡和导管内无分泌物。与正常组比较,模型组大鼠乳腺腺泡形状不规则,腺导管管腔扩张,腺泡和导管内分泌物增加。与模型组比较,柴大组大鼠乳腺腺泡形状见规则,但仍伴有不规则腺泡,腺泡和导管内分泌物见少,柴小组大鼠乳腺腺泡见规则,以不规则腺泡居多。(4)乳腺癌前基因的变化:与正常组比较,模型组大鼠乳腺Survivin和TIMP-2表达明显升高(p0.01)、血清TFF1、TFF3表达明显降低(p0.05)。与模型组比较,柴大组大鼠乳腺Survivin和TIMP-2表达均明显降低(p0.01),柴小组TIMP-2表达明显降低(p0.01)。与柴大组比较,柴小组大鼠乳腺Survivin表达明显升高(p0.01)。(5)PRL介导的信号通路相关指标的变化:与正常组比较,模型组大鼠乳腺PRLR、AKT、BAD、Bcl-2表达明显升高(p0.01或p0.05),MDM2和P53未见明显变化。与模型组比较,柴大组和柴小组大鼠乳腺PRLR、AKT、BAD表达明显降低(p0.01),柴小组Bcl-2表达降低(p0.05)。与柴大组比较,柴小组Bcl-2表达降低(p0.05)。结论:慢性束缚法复制的肝郁证模型雌性大鼠呈现中医证候相关的外观行为和实验室指标的改变,并伴有性腺轴功能的亢进、乳腺病理增生;乳腺组织伴有相关癌前基因表达及其PRL相关信号通路的异常,提示肝郁证乳腺增生可能存在癌前病变的分子机制。柴胡疏肝散不仅对肝郁证雌性大鼠的中医证候和实验室指标具有较好的改善作用,而且对模型大鼠的性腺轴异常和乳腺增生也有一定的防治作用,其在改善模型大鼠乳腺增生和降低血清PRL的同时,调节模型大鼠乳腺促癌/抑癌基因的表达,涉及对PRL相关信号通路的调节。研究结果为中医“肝郁证—血清PRL↑—乳腺增生—相关癌基因异常表达—柴胡疏肝散调节作用”的推测提供了 一定的生物学证据。该研究为认识中医“肝郁”与女性乳腺增生性疾病关联和中医辨证论治“未病防变”的科学内涵提供了现代病生理及分子生物学基础,为柴胡疏肝散防治乳腺癌的效用机制提供了一定的实验依据。
【图文】：

第一周第二周第三周第四周逡逑图１－１各组大鼠不同时间点活动状态的积分变化逡逑各组大鼠的情绪睡眠评分见表１－２和图１－２。由表１－２可以看出，与正常组比较，模逡逑型组大鼠第一周情绪睡眠评分未见明显变化0７＞０．０５），第二周至第四周情绪睡眠评分逡逑均明显升高（／Ｋ０．０１）；与模型组比较，柴大组第三周、第四周情绪睡眠评分明显降低逡逑（ｐ＜０．０１）；与柴大组比较，柴小组第三周、第四周情绪睡眠评分降低（尸＜0．0５）。逡逑由图１－２可以看出，，正常组大鼠不同时间点的情绪睡眠积分未见明显变化，模型组逡逑和各给药组大鼠第一周至第二周的情绪睡眠积分均升高，模型组和柴小组第三周积分变逡逑化相近，柴大组第三周后积分降低。逡逑表１－２各组大鼠不同时间点情绪睡眠的积分变化（５±ｓ，邋ｎ＝１０）逡逑￣ＨＩ逦ｉｉｉ逦第１周逦第２周逦第３周逦第４周逡逑正常组逦１．９３士０．２１逦１．９７±0．１１逦２．０７±0．２４逦１＿９９±０．２９逡逑模型组逦一逦１．９８±０．３３逦２．７３±０．７６＊＊逦３．６７±0．２０＊＊逦３＿９９±０．１７”逡逑柴大组逦１．２４邋ｇ／ｋｇ逦１．９４±０．３２逦２．７２±0．５３

第二周第三周第ｋ周第０周逡逑图１－２各组大鼠不同时间点情绪睡眠的积分变化逡逑各组大鼠的饮食大便评分见表１－３和图１－３。由表１－３可以看出，与正常组比较，模逡逑型组大鼠第一周至第四周的饮食大便积分明显升高０＜0．0１）；与模型组比较，柴大组逡逑第三周至第四周饮食大便积分降低（ｐ＜0．0５），以第四周降低最为明显（ｐ＜０．０１）；与柴逡逑大组比较，柴小组第三周至第四周饮食大便积分升高（Ｐ＜0．0５）。逡逑由图１－３可以看出，正常组大鼠不同时间点的饮食大便积分未见明显变化，模型组逡逑和各给药组大鼠在第一周和第二周的饮食大便积分升高，模型组和柴小组第三周后积分逡逑变化相近，柴大组第三周后积分降低。逡逑表１－３各}D大鼠不同时间点饮食大便的积分变化Ｕ±ｓ，邋ｎ＝１０）逡逑组别逦ｉｌ逦第１周逦第２周逦第３周逦第４周逡逑正常组逦＝逦１．０３±０．１３逦１．０５±０．１４逦１．１１±０．３９逦１．１７±０＿１７￣逡逑模型组逦一逦１．９４±０．３０”逦２．８９±０．４７＊＊逦３．０３±０．３邋广逦３．０７邋士邋０．６３”逡逑柴大组逦１．２４邋ｇ／ｋｇ逦１．９３±0．４９＂逦２．８８±０．２２＊＊逦２．３５±０．５２＊＊＃逦１．９９±０．２１
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

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本文编号：2599662