【摘要】：背景和目的:肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC),在我国的恶性肿瘤中发病率及死亡率均较高,2017年国家癌症中心发布的报告显示,肝细胞癌(简称肝癌)的发病率在男性位居第三,女性排名第六,而肝癌的死亡率更是高居第三。肝癌早期无典型的临床症状,只有约30%~40%患者能够接受根治性的治疗,许多患者就诊发现时已属于晚期。而肝癌患者的根治性治疗,无论肝移植还是手术切除,以及射频消融等治疗手段,都无法回避相对较高的复发率,其5年复发率高达70%。尽管精准肝切除及解剖性肝切除的理念及方法得到了广泛的应用及推广,但这些都并没有带来明显改善肝癌的复发率及预后。随着靶向及免疫治疗在肿瘤治疗中取得的突破性进展,寻找肿瘤治疗的靶点成为了新的研究热点。而在肝癌的研究中,缺乏有效的全身治疗药物已成为肝癌综合治疗的瓶颈,目前仍没有找到明确的靶点。因此,探索新的靶向治疗手段,以及加强对HCC发生发展的分子生物学机制的研究变得十分有意义。McroRNAs(miRNAs)是由22-28一组的核苷酸小分子非编码RNA(non-codingRNA,ncRNA)组成,通过碱基互补的原理,它可特异性与靶基因结合抑制其表达。大量的研究结果指出,表达水平异常的miRNA与肿瘤疾病的发生及演变间存在密切的联系。近年来,发现了大量在HCC中异常表达的miRNA,并证明参与了肝癌的相关调控。由于Dicer核酸酶在将前体miRNA加工成成熟的miRNA时,会产生两个编辑体;成熟miR-XXX-5p,miRNA源自前体miRNA的5'末端,而miR-XXX-3p miRNA源自前体miRNA的3'末端。两者的生物学功能可能并不相同,对于miRNA的精细化研究将更有利于我们了解其在肿瘤中的作用。已有报道miR-221-3p与部分肿瘤相关,但在肝癌的发生发展中是否发挥着调控作用尚未见有报道,因此,有必要去探索miR-221-3p对肝癌生物学行为的影响及其靶基因的预测。本项目研究中,首先通过实时定量qRT-PCR明确miR-221-3p在肝癌的组织和细胞株中的表达情况;然后用慢病毒转染的方法上调及下调肝癌细胞系中miR-221-3p的表达,再应用完整的细胞功能学研究:包括细胞周期试验、MTT试验、克隆能力试验、细胞凋亡试验、细胞迁移及Transwell式样等对miR-221-3p在肝细胞癌中的作用进行验证;再选择生物信息学相关技术对靶基因进行预测,经实时定量荧光试验、免疫组化及蛋白质电泳等方式明确研究miR-221-3p与下游靶基因的关系,最后用双荧光素酶报告以验证靶基因,从而明确miR-221-3p是否是通过抑制该靶基因的表达发挥在肝癌中的调控作用,发现miRNA参与肝癌调控的分子生物学机理,期望能为肝癌的临床诊疗提供有意义的指标。方法:1.检测miR-221-3p的在肝癌组织及肝癌细胞株中的表达收集新鲜标本:20对肝癌及其相应的癌旁组织,以及10例正常肝组织通过q RT-PCR检测miR-221-3p的表达。然后用qRT-PCR检测其在正常肝细胞及肝癌细胞系中的表达。2.明确miR-221-3p对肝癌细胞增殖及转移的影响使用miR-221-3p慢病毒和对照组空白慢病毒miR-CON分别转染肝癌细胞系SMMC-7721和BEL-7404两种肝癌细胞系,选择下游实验:具体包括细胞周期试验、MTT试验、克隆能力试验、细胞凋亡试验、细胞迁移及Transwell式样等方法,进一步阐述miR-221-3p在对肝癌细胞的增殖、转移及侵袭能力的作用。3.预测及鉴定miR-221-3p的下游靶基因(1)通过预测软件RNA hybrid及相关的预测网站micro RNA、Pictar和Target Scan筛选miR-221-3p的下游靶基因.(2)对20例HCC及其对应癌旁组织,以及10例正常肝组织应用免疫组化的方法检测MGMT蛋白的表达情况。(3)利用慢病毒转染的方法,将miR-221-3p转染至SMMC-7721和BEL-7404细胞中,构建上调组和下调组,利用qRT-PCR和Western Blot检测两组及其对应NC组细胞中MGMTmRNA和MGMT蛋白的表达情况,明确miR-221-3p是否是MGMT上游的调控因子。(4)用双萤光素酶报告基因系统鉴定miR-221-3p与MGMT之间是否存在互补作用,从而证实在肝癌细胞中,MGMT是否为miR-221-3p的靶基因。结果:1.miR-221-3p的在肝癌组织及肝癌细胞株中的表达(1)miR-221-3p在肝癌、对应癌旁组织及正常肝组织中的表达通过qRT-PCR检测miR-221-3p在肝癌、对应癌旁组织(20例),正常肝组织(10例)内的表达水平,研究结果指出:相比于正常组织,miR-221-3p基因能够高表达于HCC组织内,比较结果具有显著性差异(P0.01);但正常肝组织与癌旁组织内表达的miR-221-3p水平无显著性差异(P0.05)。(2)miR-221-3p于肝癌细胞系和正常肝细胞内的表达通过qRT-PCR检测,miR-221-3p在四种肝癌细胞系中的表达均高于正常细胞系HL-7702中的表达(P0.01),并且在SMMC-7721和BEL-7404肝癌细胞中表达较高。2.miR-221-3p对肝癌细胞增殖及转移的影响(1)通过慢病毒载体将miR-221-3p转染到SMMC-7721和BEL-7404细胞中,并通过q RT-PCR检测其转染效率。结果提示干扰效果显著(P0.05)。,可用于后续实验。(2)MTT实验检测转染miR-221-3p后的SMMC-7721和BEL-7404细胞,检测增殖能力,在酶标仪对波长490nm的光的吸收率变化倍数随时间变化的对比。结果显示:增殖实验开始48小时后,与NC组相比,miR-221-3p down组的BEL-7402和SMMC-7721细胞的增殖受到了明显抑制,miR-221-3p up组细胞的增殖能力明显增强(P0.05)。说明miR-221-3p具有促进肝癌细胞增殖的功能。(3)FACS细胞凋亡实验检测,慢病毒感染SMMC-7721和BEL-7404细胞,培养5天后,miR-221-3p down组与NC组凋亡率对比。相比NC组,miR-221 down组凋亡数增多(SMMC-7721;5.48%±0.07%vs4.02%±0.265%,P0.05;BEL-7404;9.17%±0.189%vs 3.92%±0,0955,P0.05),而在miR-221-3p up组,凋亡细胞与NC组比较无明显差异。结果提示下调miR-221-3p up能够促进肝癌细胞的凋亡。(4)细胞周期实验检测,慢病毒感染SMMC-7721细胞,培养5天后,miR-221 up、miR-221 down组与NC组处在G1,S以及G2/M期的细胞占细胞总数的比例。相比NC组,miR-221-3p up、miR-221-3p down组处于S期的细胞无显著变化,处于G1期的细胞减少(P0.05),处于G2/M期的细胞增多(P0.05)。在慢病毒感染BEL-7404细胞中,相比NC组,miR-221-3p up组处于S期的细胞增多(P0.05),处于G1期的细胞减少(P0.05),处于G2/M期的细胞无显著变化;miR-221-3p down组处于S期的细胞无显著变化,处于G1期的细胞减少(P0.05),处于G2/M期的细胞增多(P0.05).这说明可能不是通过影响细胞周期与肝癌细胞相互作用的。(5)本研究经划痕实验结果显示:miR-221-3p基因慢病毒感染SMMC-7721细胞,并划痕于处理后0h、24h对细胞进行拍照,miR-221-3p down组的迁移能力(计算迁移率:为不同拍照观察时间点迁移距离与“0hour”划痕区域宽度值的比值)结果显示:上调miR-221-3p后,SMMC-7721和BEL-7404细胞的迁移能力与NC组相比明显增强(SMMC-7721:0.98±0.007 vs 0.9±0.009,P0.05;BEL-7404:0.65±0.02 vs 0.43±0.02;P0.05;),下调miR-221-3p后两个肝癌细胞系的迁移能力NC组相比有明显的减弱(SMMC-7721:0.58±0.007 vs 0.9±0.009;BEL-7404:0.24±0.02vs 0.43±0.02;P0.05;)。说明miR-221-3p在肝癌中促进了细胞的迁移。(6)Transwell侵袭实验结果显示:在SMMC-7721和BEL-7404细胞中,miR-221-3p up转染组细胞的穿膜细胞数明显多于NC组(SMMC-7721:71±1.68 vs 51±0.9;BEL-7404:184±9.63VS125±1.64,P0.05),同样发现miR-221-3p down组细胞侵袭能力明显低于NC组细胞(SMMC-7721:28±2.1vs51±0.9;BEL-7404:65±11.84vs125±1.64;P0.05)。结果提示:miR-221-3p可增强SMM-C7721细胞和BEL-7404细胞体外侵袭能力,下调miR-221-3p可抑制肝癌细胞的侵袭能力。(7)克隆形成实验检测,在慢病毒感染SMMC-7721和BEL-7404细胞组中:感染3天后种板,持续培养16天。相比NC组,miR-221-3p up组克隆数增多(SMMC-7721:116±3 vs 89±4;BEL-7404:160±5vs123±6;P0.05),miR-221-3p down组克隆数减少(SMMC-7721:49±6 vs 89±4;BEL-7404:85±4vs123±6;P0.05)。说明miR-221-3p促进了肝癌细胞的克隆能力,下调后肝癌细胞的克隆能力受到明显抑制。3.预测及鉴定miR-221-3p的下游靶基因(1)生物信息学查询,筛选可能是miR-221-3p调控的靶基因。根据miR-221-3p有促癌的作用,从初选基因中预测抑癌基因MGMT可能性最大通过,并在预测软件RNA hybrid发现存在互补关系。(2)免疫组化提示MGMT蛋白的阳性表达反应物为棕黄色颗粒,主要定位于细胞浆。免疫组化结果显示:在正常肝组织中有阳性表达,在肝癌组中低表达,两者比较有显著差异(P0.05)。(3)本研究用q-PCR对转染后肝癌细胞SMMC-7721和BEL-7404中MGMTmRNA表达水平进行了检测,发现miR-221-3p down组中的表达水平明显高于NC组(P0.05);而miR-221-3p up组中表达水平明显低于NC组结果有显著性差异(P0.05)。(4)通过应用Western Blot对各组慢病毒转染不同形态miR-221-3p的肝癌细胞系SMMC-7721和BEL-7404中MGMT基因翻译蛋白的表达水平进行检测,实验发现与NC组对比,上调组的蛋白表达水平明显受到抑制,而下调组的细胞中蛋白表达水平显著上升,结果具有统计学差异(P0.05)。(5)双萤光素酶系统结果显示:miR-221-3p与MGMT存在互补关系,能通过与MGMT中存在的3'UTR端,对其表达水平进行下调。结论:1.miR-221-3p能够高表达于肝癌组织中,在肝癌细胞Hep G2、BEL-7404、Huh-7、SMMC-7721的表达明显高于正常肝细胞中HL-7702。2.miR-221-3p是肝癌的一个促癌因子,下调后可抑制肝癌细胞的增殖、侵袭及转移能力。3.MGMT是miR-221-3p的靶基因之一,miR-221-3p通过对靶基因MGMT的抑制,进而在肝癌中有助于介导癌细胞的增殖、转移及侵袭等进程。
【图文】：
所有数据的统计分析使用软件 SPSS19.0。经非参数检荧光定量测定结果，经单因素方差对不同组别的 qRT-比较分析。验结果 的提取估本研究所提取的总 RNA，对其纯度及浓度进行检测，1%）检测 3 条清晰 rRNA 带，，分别为 28s、18s 及 5s ，表明具有良好的质量（见图 1）。
MicroRNA-221-3p 通过抑制靶基因 MGMT 促进肝癌细胞的增殖、转移和侵袭 2.2 正常组织、肝癌及其癌旁组织内表达的 miR-221-3p 水平经 qRT-PCR 技术检测 HCC 及其癌旁组织（20 例）、正常肝组内表达的 miR-221-3p 水平，研究结果指出：相比于正常组织，m基因能够高表达于 HCC 组织内，比较结果具有显著性差异（P<0正常肝组织与癌旁组织内表达的 miR-221-3p 水平无显著性差异（见图 1-2）。
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R735.7
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9 荣震;许s
本文编号：2599675
