水稻MRE11基因不同等位变异的创建与功能解析

发布时间：2020-03-25 15:48

【摘要】：有丝分裂和减数分裂是生物体中非常重要的细胞分裂过程。有丝分裂在维持生物个体的正常生长和发育中起着重要作用;减数分裂保证有性生殖生物世代之间染色体数目的稳定性,亦为有性生殖过程中创造变异提供了遗传的物质基础。DNA双链断裂(DSB)作为一种DNA损伤现象,对有丝分裂和减数分裂都有着重要影响。MRE11是一个与细胞分裂相关的重要基因,已有研究表明该基因与DNA损伤修复有着重要关系。MRE11与RAD50和NBS1共同组成MRN复合体,参与DNA损伤修复,任一蛋白的缺陷都会严重影响DNA修复过程。目前有关OsMRE11基因对水稻有丝分裂和减数分裂调控的研究较少,因此我们以OsMRE11为对象,通过对该基因在水稻中不同等位突变的表型分析及目标蛋白的功能研究,来探索MRE11蛋白在DSB修复途径中的详细作用,以期望初步解析其在有丝分裂及减数分裂这两种细胞分裂方式中的功能差异。本研究中,我们通过T-DNA插入突变体鉴定及CRISPR/Cas9技术,获得水稻OsMRE11三个不同等位突变体,分别命名为Osmre11-1、Osmre11-2和Osmre11-3。通过对三者营养生长及生殖生长的详细观察和分析,我们发现不同Osmre11等位突变体均表现出明显的配子发生缺陷,植株不育。细胞学分析显示突变体花粉母细胞染色体行为异常,终变期及中期Ⅰ发生染色体黏连,后期Ⅰ产生大量染色体碎片,导致遗传物质不能在子代细胞均等分配,致使植株不育。以上减数分裂异常表型与已报道的OsMRE11RNAi株系中获得的结果一致。在此基础上,我们采用免疫染色方法检测突变体中DSB形成和修复相关蛋白的定位情况,以及联会复合体形成状态。结果显示,DSB指示信号γH2AX定位与野生型中结果相比没有显著差异,突变体前期Ⅰ早期染色体轴相关蛋白PAIR2和PAIR3可组装成线,但是联会复合体横丝蛋白ZEP1的装配及延伸无法正常进行。而DSB修复相关蛋白OsDMC1则无法定位于突变体减数分裂染色体上,同时DSB修复产物交叉的指示蛋白HEI10的定位亦受到明显影响。上述结果表明OsMRE11对于水稻减数分裂同源重组及同源染色体联会是必须的。通过对水稻Osmre11-1、Osmre11-2和Osmre11-3这三个不同等位突变体营养生长观察发现,Osmre11-1和Osmre11-2的营养生长受到了明显抑制,幼苗和成株的高度约为野生型高度的50%;与之相异的是,Osmre11-3突变植株的营养生长基本正常,植株高度未受影响。比较分析Osmre11-1、1-2和Osmre11-3的突变位点,我们发现三个不同等位突变体中突变基因均编码蛋白发生移码并提前终止,而(Osmre11-2和OOsmre11-3两者编码的截断蛋白仅相差29个氨基酸。结合表型与序列分析我们推测这29个氨基酸很可能是OsMRE11调控水稻有丝分裂的特异位点。综上所述,本研究通过对水稻OsMRE11基因不同等位突变的表型研究及蛋白结构分析,证明OsMRE11通过参与水稻性母细胞同源修复过程而调控减数分裂。这种调控作用依赖于OsMRE11蛋白整体功能,不存在位点差异;而OsMRE11在水稻有丝分裂过程中的重要作用很可能存在氨基酸位点差异性。有关OsMRE11对水稻两种细胞分裂方式的差异调控,需要进一步研究及验证。
【图文】：

图１．１有丝分裂的基本过程逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１邋Ｔｈｅ邋ｂａｓｉｃ邋ｐｒｏｃｅｓｓ邋ｏｆ邋ｍｉｔｏｓｉｓ．逡逑１．４减数分裂主要过程逡逑减数分裂和有丝分裂相比，有其特殊的地方，也有很多共同点。减数分裂同样分为裂间期和分裂期两部分，在整个过程中ＤＮＡ同样复制一次，经历前中后末四个时期。是减数分裂过程中细胞会分裂两次，而且减数第一次分裂的前期持续时间相对较长，发许多重要的生物学事件。逡逑１．４．１减数第一次分裂逡逑前期Ｉ：逡逑该时期是减数分裂中相当重要的时期，被分为细线期、偶线期、粗线期、双线期和。逡逑

ＭＩＴＯＳＩＳ逡逑５．邋Ａｎａｐｈａｓｅ逡逑图１．１有丝分裂的基本过程逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１邋Ｔｈｅ邋ｂａｓｉｃ邋ｐｒｏｃｅｓｓ邋ｏｆ邋ｍｉｔｏｓｉｓ．逡逑１．４减数分裂主要过程逡逑减数分裂和有丝分裂相比，有其特殊的地方，也有很多共同点。减数分裂同样分为分逡逑裂间期和分裂期两部分，在整个过程中ＤＮＡ同样复制一次，经历前中后末四个时期。但逡逑是减数分裂过程中细胞会分裂两次，而且减数第一次分裂的前期持续时间相对较长，发生逡逑许多重要的生物学事件。逡逑１．４．１减数第一次分裂逡逑前期Ｉ：逡逑该时期是减数分裂中相当重要的时期，被分为细线期、偶线期、粗线期、双线期和终逡逑变期五个部分。逡逑细线期：染色质开始浓缩成染色体的形态，呈细长的细线状，ＤＮＡ复制已经完成，，细逡逑胞核和核仁的体积开始增大。联会复合体轴向元件开始组装，程序性ＤＮＡ双链断裂开始逡逑发生，普遍认为细线期是减数分裂的起始。逡逑偶线期：染色体继续浓缩
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S511

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本文编号：2600096