柞蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂6基因（Apserpin-6）的克隆与功能分析

发布时间：2020-03-25 22:33

【摘要】：蛋白酶抑制剂是一类能抑制蛋白酶的水解活性的多肽或蛋白,广泛存在于生物体内,在许多生命活动过程中都发挥着必不可少的作用。Serpin是丝氨酸蛋白酶抑制剂中数量最多、分布最广的一个超家族,它主要通过调控丝氨酸蛋白酶(serine proteases,SPs)和半胱氨酸蛋白酶(cysteine proteases,CPs)的活性来发挥作用。昆虫serpin可以通过抑制丝氨酸蛋白酶的活性调控机体的免疫防御反应。为了阐明serpin在柞蚕(Antheraea pernyi)免疫防御系统中的作用,从serpin基因的克隆入手,研究了serpin基因的结构、进化以及表达特征等信息,为进一步研究柞蚕对病原微生物的免疫防御反应奠定基础,结果如下:1.柞蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂6基因(Apserpin-6)的克隆依据柞蚕中肠转录组数据库中一段编码serpin的CDS序列设计PCR引物,以柞蚕幼虫总cDNA为模板克隆得到一段全长1 239 bp的序列,经序列分析后命名为柞蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂6基因(Apserpin-6)(GenBank登录号:MF944108)。该基因编码412个氨基酸残基,其中N端第1~17位氨基酸为信号肽序列,在C端第357~391位氨基酸之间有一个反应中心环(RCL),第374位丝氨酸(Serine)和第375位丝氨酸之间是预测的蛋白质裂解位点,证明其属于serpin超家族,是典型的抑制型serpin。预测的Apserpin-6蛋白的分子质量(Mw)为46.49 kDa,等电点(pI)为7.15,含有6个磷酸化位点。2.柞蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂6基因(Apserpin-6)系统进化分析序列同源性分析表明,Apserpin-6与其他昆虫serpin-6序列之间具有高度的相似性,系统进化分析表明Apserpin-6与烟草天蛾(Manduca sexta)Msserpin-6、家蚕(Bombyx mori)Bmserpin-6及野桑蚕(Bombyx mandarina)Bmdserpin-6之间的亲缘关系较近,且与Bmserpin-6、Bmdserpin-6聚在一个分支上。3.柞蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂6基因(Apserpin-6)的表达谱分析半定量RT-PCR结果显示Apserpin-6在柞蚕5龄幼虫的脂肪体中表达水平最高,血淋巴和头部组织次之,在中肠、马氏管和丝腺中的表达水平较低;荧光定量RT-PCR检测发现受到柞蚕肠球菌(Enterococcus pernyi)、白僵菌(Beauveria bassiana)以及柞蚕核型多角体病毒(Antherea pernyi nucleopolyhedrovirus)侵染后柞蚕幼虫的血淋巴中Apserpin-6表达量均显著上调。4.柞蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂6基因(Apserpin-6)的原核表达及功能分析利用原核表达系统pEASY~?-Blunt E1-Apserpin-6/BL21(DE3)表达重组Apserpin-6蛋白,重组蛋白经镍离子鳌合亲和层析分离纯化后用于体外试验,检测其对柞蚕幼虫血淋巴中的酚氧化酶前体(prophenoloxidase,proPO)活化及酚氧化酶(phenoloxidase,PO)酶活的抑制作用,试验结果显示该重组蛋白能够抑制proPO的活性,但对PO活性没有影响。综上,本研究克隆得到了柞蚕一个抑制型serpin的基因——Apserpin-6,该基因在血淋巴中表达水平受病原菌诱导后明显上调;原核表达的重组Apserpin-6蛋白体外活性试验提示Apserpin-6可能作为一种负调控因子参与proPO的活化进程,从而调控柞蚕血淋巴中PO参与的抗病原菌免疫防御反应。
【图文】：

nevadensisZootermopsis nevadensis2.4 结果与分析2.4.1 柞蚕总 RNA 的检测提取的柞蚕总 RNA 样品 1.2%琼脂糖凝胶电泳检测显示无基因组 DNA 污染（图2-1），，并且分光光度法检测其 OD260/OD280 值为 1.96，RNA 样品浓度为 676.23 μg mL-1（表 2-5），表明提取的柞蚕 RNA 纯度较好，可用于下一步试验。表 2-5 分光光度计检测柞蚕 RNA 样品质量Table 2-5 The quality of extracted A. pernyi RNA detected by spectrophotometer样品 OD260/OD280 浓度（μg mL-1）柞蚕总 RNA 1.96 676.23

琼脂糖凝胶电泳检测柞蚕 RNAd A. pernyi total RNA detected b蚕总 RNA。Note: M represents 10 kb A 样进行反转录得到 cDNA后照胶，发现大小约 1.2 k序列大小相符，初步判断扩
【学位授予单位】：沈阳农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S885.1

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本文编号：2600540