草鱼呼肠孤病毒三种基因工程疫苗创制及免疫效果评价

发布时间：2020-03-26 02:47

【摘要】：草鱼(Ctenopharyngodon idella)是我国重要的淡水养殖鱼类之一,而草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)引起的草鱼出血病,是危害草鱼养殖业的主要病毒性疾病。草鱼呼肠孤病毒为双链RNA病毒,含11个基因片段编码11~12个蛋白,同时根据基因型分类为GCRV I型、II型和III型,其中II型是主要的流行病毒,致死率高。但是目前针对II型GCRV的疫苗种类很少,无法满足生产实际的需要,严重制约着草鱼养殖业的健康发展。本论文以草鱼呼肠孤病毒河南分离株GCRV-HN14为研究对象,生物信息学分析为II型草鱼呼肠孤病毒,其中S11序列片段编码的VP35蛋白含有锌指结构基序,该基序也存在于其他呼肠孤病毒外衣壳蛋白中,所以推测VP35是外衣壳蛋白;S7序列编码的VP56蛋白类似腺病毒的纤维突起蛋白,称为类纤突蛋白,推测其具有类似于纤突蛋白中和病毒的能力而表现较好的免疫原性。基于此,本论文采用S11节段,构建真核和原核表达载体,制备DNA疫苗和亚单位疫苗,针对S7节段制备亚单位疫苗,分别免疫草鱼后检测了一系列免疫保护指标进行疫苗效果评价。本文的主要内容如下:1.DNA疫苗的制备与免疫效果评价以GCRV-HN14病毒基因组为模板,通过反转录、基因克隆,获得S11片段。将S11序列ORF插入pcDNA3.1(+)真核表达载体,构建重组表达载体pcDNA3.1-s11并测序验证,重组质粒作为DNA疫苗。通过Western blot验证,pcDNA3.1-s11在草鱼肾细胞中成功表达重组蛋白VP35。之后,以10μg pcDNA3.1-s11肌肉注射草鱼,设PBS为对照组,pcDNA3.1(+)为空载体组,于免疫后1、7、14、21、28、35、42和49 d收集样品,采用一系列指标评价免疫保护效果。结果如下:(1)质粒在鱼体内分布表达检测:通过PCR检测,在血液、肝脏、脾脏、肾脏和肌肉中均有pcDNA3.1-s11分布;通过Western blot检测质粒表达,仅在肌肉中有重组蛋白VP35表达。(2)外周血细胞数量变化以及白细胞分类计数:pcDNA3.1-s11疫苗免疫草鱼后,各组间红细胞数量没有显著性差异(p0.05);与对照组相比,免疫组白细胞数量在免疫后1、7和14 d显著增加(p0.05或p0.01);免疫草鱼体内中性粒细胞和淋巴细胞的比例明显增高,在7 d单核细胞百分比达到峰值[(24.13±2.38)%;p0.01],在14 d淋巴细胞比例达到峰值[(93.30±4.71)%;p0.05]。(3)血清抗体效价检测:在免疫后7 d,免疫草鱼体内产生了抗VP35蛋白的抗体,免疫后28 d抗体效价最高(OD_(450nm)为0.79±0.06;p0.01)。(4)免疫相关基因:IFN1、TLR22、MHC I和IgM在头肾和脾脏中的相对表达量变化显示,四种免疫基因的表达量在免疫后均有不同程度的上调。与对照组相比,头肾中IFN1在免疫后7 d开始上调,第14 d呈现最高,上调11.68倍(p0.01);脾脏中IFN1在14 d上调,第21 d达到峰值,上调17倍左右(p0.01)。头肾与脾脏的TLR22在1 d显著上调,在第14 d达到最高,分别约上调6倍和120倍(p0.05或p0.01)。头肾与脾脏的MHC I的表达变化与TLR22相似,在1 d开始上调,第21 d达到峰值(p0.05或p0.01)。头肾与脾脏的IgM在7 d开始上调,分别在35 d和28 d上调11.59倍和17.84倍,达到峰值(p0.01)。(5)免疫保护率:在免疫后21 d攻毒,pcDNA3.1(+)组和空白对照组的死亡率在90%~95%,pcDNA3.1-s11免疫组死亡率为26.7~29.6%,DNA疫苗的相对保护率约为70%。2.VP35亚单位疫苗的制备与免疫效果评价将S11片段克隆到原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET32a-VP35,转化大肠杆菌DE3。通过SDS-PAGE对重组蛋白(rVP35)的可溶性分析,rVP35主要以包涵体形式存在。同时优化重组蛋白表达条件后,选择1 mM IPTG诱导6 h,进行诱导表达。Ni柱纯化及复性获得重组蛋白,以每尾腹腔注射30μg rVP35免疫草鱼,于免疫后1、3、5、7、14、21、28和35 d收集样品,进行一系列指标评价免疫保护效果。结果如下:(1)外周血细胞数量以及白细胞分类比例变化:rVP35免疫后,白细胞数量显著高于对照组,其中单核细胞、中性粒细胞和淋巴细胞百分比显著升高。免疫草鱼体内红细胞数目维持在(2.03±0.07)×10~9/mL,与对照组无差异(p0.05)。白细胞数量在第3 d开始升高,第5 d达到峰值[(7.92±0.72)×10~7/mL;p0.05];中性粒细胞和单核细胞百分比在免疫第3 d升高并达到峰值分别为(18.70±1.78)%和(12.22±1.28)%(p0.05);随后淋巴细胞百分比在免疫第14 d显著升高达到峰值[(92.37±3.11)%;p0.01]。(2)血清抗体效价检测:在免疫第14 d草鱼体内产生了抗VP35蛋白的抗体,免疫后21 d抗体效价最高(OD_(450nm)为0.65±0.07;p0.01),在免疫第35 d仍有较高水平的抗体存在。(3)免疫相关基因:IFN1、TLR22、MHC I和IgM在头肾和脾脏中的相对表达量变化显示,与对照相比,IFN1在头肾和脾脏的相对表达量在第5 d开始升高,分别在第14 d和7 d达到峰值,上调30~40倍(p0.01);TLR22的相对表达量在第3 d显著上调,在头肾中上调4.04倍,在脾脏中上调10.55倍(p0.01);MHC I的相对表达量在第1 d开始升高,在第5 d达到峰值上调7~12倍(p0.01);在头肾和脾脏中IgM的相对表达量分别在第14 d和5 d开始上调,在头肾中第21 d上调30倍左右(p0.01),在脾脏中第28 d上调20倍左右(p0.01)。(4)相对免疫保护率:在免疫第21 d攻毒,免疫组和对照组存活率约为66.7%和16.7%,rVP35蛋白亚单位疫苗的相对保护率为60%。3.VP56亚单位疫苗的制备与免疫效果评价将S7节段C端993 bp序列克隆到原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET32a-VP56。选择1mM IPTG诱导6 h,进行诱导表达重组蛋白(rVP56),可溶性分析显示,rVP56以包涵体形式存在。Ni柱纯化及复性获得重组蛋白,以每尾鱼30μg腹腔注射免疫草鱼,于免疫后1、3、5、7、14、21、28和35 d收集样品,进行免疫保护效果评价。结果如下:(1)草鱼外周血细胞数量变化以及白细胞分类计数:与对照组相比,免疫组红细胞在第5 d显著升高,第7 d达到峰值[(2.98±0.17)×10~9/mL;p0.05];白细胞数量在第5、7和14 d显著高于对照组(p0.05或p0.01),在7 d达到峰值[(8.42±1.00)×10~7/mL,p0.05]。单核细胞、中性粒细胞百分比变化趋势相似,均在第5 d达到峰值分别为(9.05±0.92)%和(25.93±2.60)%(p0.05或p0.01);随后淋巴细胞大量增殖,在14 d淋巴细胞比例达到峰值[(85.81±2.73)%,p0.01]。(2)抗体效价检测:免疫后草鱼体内产生了抗rVP56的抗体,在21 d最高,OD_(450nm)为0.34±0.01(p0.01)。(3)实时荧光定量PCR检测免疫相关基因结果显示,IFN1、TLR22和MHC I的相对表达量在免疫前期上调明显,IFN1和MHC I基因的相对表达量在头肾和脾脏组织中在第5 d上调到峰值,其中头肾的IFN1和MHC I的相对表达量分别为19.71和38.18(p0.01),脾脏中的IFN1和MHC I的相对表达量分别为7.65(p0.01)和7.73(p0.05)。TLR22的相对表达量在头肾中第5 d上调至峰值为3.25,在脾脏中第3 d上调至峰值为9.78(p0.01)。IgM的相对表达量在头肾和脾脏中在第21 d上调至峰值分别为47.22(p0.01)和18.91(p0.05)。(4)相对免疫保护率:攻毒试验显示,rVP56免疫保护草鱼后,存活率为73.3~76.7%,而对照组存活率仅为6.67~16.7%左右,相对保护率约为75%。本研究基于本地分离的草鱼呼肠孤病毒,采用基因工程方法创制了三种基因工程疫苗。免疫草鱼后,采用不同的免疫指标,分别对其免疫效果进行评价,发现三种不同疫苗均具有较好的免疫保护,相对免疫保护率在60%以上,最高为75%,表明这三种基因工程疫苗均具有工程化开发价值和应用前景。但疫苗创制方法、免疫剂量和免疫途径仍需进一步优化,以增强免疫效果和提高相对免疫保护率。
【图文】：

图 2 表示 DL1 PCR amte: Lane M2-1 S11 片段L2000；1、2mplication ofM: DL2000;扩增结果表示 S11PCS11 segmentLane 1 and 2Ct b2:

转染,脂质,质体,细胞的

示 pFig; Lan dige C-s11后，一条图pcDNA3.1(+)g.2-3 Digestione 1: pcDNAested by BamHCIK 细胞的1、空载体Western blo条特异条带，，10002-3 双酶切)；2 表示 pcDon identificatA3.1(+); LanemH I.的表达pcDNA3.1ot 检测转染在空载体M 1切验证NA3.1-s11 双tion of pcDNA2: pcDNA3.(+)通过脂质染后细胞，重pcDNA3.1(2 3双酶切产A3.1-s111-s11 dige质体 Lip重组质粒(+)和未
【学位授予单位】：河南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S943

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