血管内皮细胞中生存素（Survivin）基因多效性分析

发布时间：2020-03-28 12:59

【摘要】：动脉硬化为中老年常见疾病,随着高血压、高血糖、高血脂等发病率不断增高,动脉粥样硬化引起的心肌梗死、脑梗塞和肢体缺血坏死等危及生命的疾病越来越多,主要表现为动脉狭窄,内膜增生闭塞或栓塞,同时,内膜增生常伴随疾病的发生发展,目前主要治疗方式药物及手术治疗均无法逆转这一病理改变,它也是动脉旁路手术,介入手术后再狭窄闭塞的重要原因,以下肢动脉动脉闭塞最为常见。在外周血管疾病(periphery artery disease,PAD)治疗中侧支循环的建立能一定程度改善相应的症状,减缓疾病的进展甚至到达治愈的疗效,这一过程中血管内皮细胞(Vascular Endothelial Cells,VECs)的激活、增值、迁移、管腔结构的形成及塑性,并以出芽的方式形成新生血管网为保障侧支循环建立的关键所在,侧支循环建在增加末梢血量、改善循环灌注的同时,也可提升血管重建术后的长期通畅率。然后,研究表明成熟的VECs在病例生理情况下存在活性低,生长缓,更新慢等缺陷,极大程度的限制了在临床治疗中的应用。因此,如何赋予VECs抗凋亡、促增值、易迁移等特征为目前动脉硬化治疗急需解决的一大难题。生存素(Survivin,SVV)为 LAP(inhibitors of apoptosis protein)家族中分子量最小的成员,可与多种细胞周期及分裂相关蛋白如INCENP、Aurora B、CyclinD等发生交联反应从而提升细胞生存率。同时,SVV也能通过caspase依赖与非依赖细胞凋亡途径抑制细胞死亡过程。目前研究推测SVV可与caspase 3的感受器或效应器结合从而抑制细胞凋亡[1],也有报道指出SVV可直接与caspase 9结合抑制其凋亡活性[2]。最新研究表明SVV不仅在肿瘤细胞中表达上升,在人胚胎干细胞与多种体干细胞中也有显著表达,同时在未分化成熟的鳞状上皮、粘膜上皮细胞中也可检测到SVV表达,如食管上皮细胞、胃粘膜细胞及肾小管上皮细胞等[3,4],参与调控此类细胞对于内环境变化的所做出的相应反应并决定细胞的转归。SVV作为肿瘤非特异性基因,对细胞分化与凋亡调节有关键作用,在体内受到严格的调控,通常不参与细胞的肿瘤样变。本研究验证内皮细胞中SVV的表达情况,通过上调SVV的表达探讨其基因多效性对内皮细胞增值及凋亡等生物活性的影响,并对其机制进行进一步分析,同时体内验证内皮细胞中SVV基因对血管新生的作用,为周围血管疾病的基因靶向治疗奠定相应理论基础。第一部分内皮细胞中Suvivin基因的验证目的:验证内皮细胞中Survivin基因的表达情况方法:收集对数期生长的大鼠血管内皮细胞,采用真核细胞裂解液按照说明提取内皮细胞蛋白,通过western-blot及RT-PCR验证大鼠血管内皮细胞中Survivin基因(BIRC-5)在蛋白和核酸水平的表达情况。结果:western-blot结果显示各组大鼠血管内皮细胞在蛋白水平均可见Survivin蛋白表达,灰度值为70.45±3.586;同时RT-PCR结果提示BIRC-5在正常大鼠血管内皮细胞中均有表达,2-ΔΔCt为0.83±0.045。结论:Survivin蛋白及其编码基因BIRC-5在正常大鼠血管中均存在低表达。第二部分通过腺病毒转染过表达内皮细胞中Survivin 基因目的:上调内皮细胞中Survivin基因为其多效性研究构建理想细胞模型方法:构建携带目的基因(BIRC-5)及绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)的腺病毒载体,通过 MOI 梯度(100MOI、200MOI、300MOI)转染大鼠血管内皮细胞,在24h、48h荧光倒置显微镜观察GFP表达情况,摸索最适MOI。并通过western-blot及RT-PCR从蛋白及核酸水平验证Survivin基因的上调情况。结果:不同MOI转染结果显示,各组细胞在24、48h荧光强度呈递增趋势,且300MOI24h转染效率最佳,可达95%,western-blot结果显示300MOI转染组Survivin蛋白表达相应升高。PT-PCR结果显示BIRC-5较对照组显著升高。结论:Ad-GPF/SVV具有较高的转染率,对大鼠血管内皮细胞中Survivin基因表达有显著的提升第三部分体外验证Survivin基因多效性对内皮细胞生物学活性的影响及其机制的研究目的:证实上调Survivin基因可使内皮细胞获得促增值、抗凋亡、易侵袭等生物活性并验证其调控靶点方法:Ad-GFP/SVV于300MOI转染大鼠血管内皮细胞,24小时后通过流式细胞仪、CCK-8、transwell试剂盒体外检测过表达Survivin基因内皮细胞的凋亡、增殖及侵袭活性变化,采用western-blot检测细胞周期蛋白Cyclin D及与survivin交联组成CPC的染色体过客蛋白INCENP及Aurora B蛋白及凋亡相关蛋白Caspase-3、bcl-2。通过RT-PCR 检测 Caspase-3、bcl-2 mRNA 的变化,ELISA 检测 MMP-2、MMP-9、Ang-2分泌情况。结果:上调内皮细胞中Survivin基因后其增值活性较对照组明显增加,细胞周期蛋白CyclinD及有丝分裂调控蛋白INCENP、AuroraB及磷酸化Aurora B表达水平相应提升,同时,Survivin基因过表达提升内皮细胞抗凋亡能力,并从核酸和蛋白水平促进了 bcl-2的表达,抑制Caspase-3的表达从而失活了其介导的凋亡通路。内皮细胞中Survivin基因表达提升同样促进了其侵袭能力,分泌MMP-2、MMP-9、Ang-2较对照显著增加。结论:大鼠血管内皮细胞胞质中Survivin的上调对其增殖,抗凋亡及侵袭能力均有显著的影响。一定程度克服了其生理情况下生物活性低的缺陷。第四部分体内证实Survivin基因多效性促进新生血管生成目的:体内验证上调Survivin基因促进血管内皮细胞血管新生能力方法:通过肌肉注射将过表达Survivin基因的RAECs移植于裸鼠下肢肌肉组织中,2周后取组织以石蜡及冰冻切片,采用免疫组织化学检测CD31阳性的内皮细胞并计算新生微血管数量。同时,HE染色验证细胞异性型,排除其肿瘤样变。通过荧光双标检测新生微血管中CD31、Survivin 的表达。结果:细胞移植两周后,Survivin过表达组新生微血管数较对照组明显增加。HE染色各组均未见内皮细胞核形态异常,核质比例增大等肿瘤样变性,实验组新生血管内皮细胞中Survivin见显著表达。结论:构建的增殖型腺病毒通过提升内皮细胞中Survivin基因的表达,改变其生物活性从而获得较强的血管新生能力,并一定程度抵消了同种异体排除反应。
【图文】：

表达水平,管内,抗凋亡,有丝分裂

为明确ＲＡＥＣｓ中ＢＩＲＣ－５基因转录水平，将多组培养细胞（生长至８０％－９０％）逡逑进行ＲＮＡ提取，逆转录生成ｃＤＮＡ，并进行ＲＴ－ＰＣＲ检测，每个样本重复３次，逡逑取平均值，结果显示，在培养的ＲＡＥＣｓ中，ＢＩＲＣ－５转录均为阳性（附图２），且逡逑转录水平相对较低，２－ＡＡＧｔ邋Ｓ邋０．８３±０．０４５。逡逑｜逡逑Ｕｎｌｌ逡逑＂Ｂ邋Ｏ－Ｏ１逦ｌ逦ｆ逦Ｉ逡逑｜逦ＮＵＲＡＥＣｓ邋ＮＩ－ＲＡＥＣｓ邋ＮＩ－ＲＡＥＣｓ逡逑图２大鼠血管内皮细胞中Ｓｕｒｖｉｖｉｎ邋ｍＲＮＡ的相对表达水平逡逑Ｆｉｇ．２邋Ｔｈｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ｒｅｌａｔｉｖｅ邋ｓｕｒｖｉｖｉｎ邋ｍＲＮＡ邋ｉｎ邋ＲＥＡＣｓ逡逑３讨论逡逑Ｓｕｒｖｉｖｉｎ为ＩＡＰ家族中分子量最小成员，蛋白分子量仅为１６＿５ｋＤａ，同时也被成逡逑为复合蛋白邋５邋重复序列（ｂａｃｕｌｏｖｉｒａｌ邋ＬＡＰ邋ｒｅｐｅａｔ－ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋５，邋ＢＩＲＣ－５），是目逡逑前已知的最强的抗凋亡因子，参与细胞周期Ｇ２／Ｍ期及细胞抗凋亡的调控［７］。在有逡逑丝分裂过程中，Ｓｕｒｖｉｖｉｎ蛋白可通过细胞周期蛋白ＣＣＮＤ１、ＣＤＫＮ１Ｂ、ＣＤＣ２、逡逑ＣＤＫ９［８］以及与有丝分裂效应器直接关联，在参与调解有丝分裂各阶段微管结构的逡逑稳定及降解的同时，也可特异性参与Ｇ１期向Ｓ期的调控［９］，促进细胞的增殖。目逡逑前普遍认为

腺病毒感染,蛋白表达,情况,蛋白

２．２邋Ｓｕｒｖｉｖｉｎ蛋白及基因表达水平的检验逡逑Ｗｅｓｔｅｍ－ｂｌｏｔ邋结果显示邋Ａｄ－ＧＦＰ／ＳＷ邋以邋３００ＭＯＩ、２４ｈ邋转染后，，Ｓｕｒｖｉｖｉｎ邋蛋白表逡逑达相应提升，见图３ａ，用ｉｍｎａｇｅＪ软件分析条带灰度值，计算出ＣＯＮ组ＳＷ蛋逡逑白表达量为邋７４．６０士２．５５０，邋１Ｎ邋组为邋８０．４２士３．４５９，邋Ａｄ－ＧＦＰ／ＳＷ邋组为邋１７４．５０±１２．６３０，逡逑单因素方差分析结果提示差异有统计学意义（尸＜０．０５），组间两两比较采用ＬＳＤ－ｔ逡逑检验，Ａｄ－ＧＦＰ／ＳＷ组ＳＷ蛋白较ＩＮ组增高（尸＝０．０００），同时较ＣＯＮ组也相应逡逑升高００．０００）邋，］Ｎ组与ＣＯＮ组比较差异无统计学意义（尸＞０．０５）。ＲＴ－ＰＣＲ检逡逑测得到各组基因Ｃｔ值，目的基因ＢＩＣＲ－５邋ｍＲＮＡ与内参基因ＧＡＤＰＨ的扩增效果逡逑一致，可运用２＿ＡＡｃｔ法计算各组细胞中ＢＩＲＣ－５基因的转录量相对于标准基因转录逡逑量的倍数，计算得ＩＮ组ＢＩＲＣ－５基因的转录量为０．９３±０．３０７，ＣＯＮ组为１．０５±０．２１６，逡逑Ａｄ－ＧＦＰ／ＳＷ邋组为邋２．００３±０．３２１
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R543.5

【参考文献】