西南地区三种胁迫条件下玉米转录组分析及胁迫响应基因功能研究

发布时间：2020-03-29 07:50

【摘要】：植物在生长发育过程中需要抵御复杂多样的生物及非生物胁迫,如营养胁迫、重金属胁迫、真菌病害胁迫,而胁迫往往同时或接连发生,甚至存在一定的相互作用。植物在长期进化过程中建立了复杂且精密的分子调控网络以抵御这些胁迫。植物激素及重要的功能蛋白如转录因子、转运蛋白、病程相关蛋白通常参与了植物对多种胁迫的响应过程。已有研究发现,植物响应胁迫的机制存在一定的交叉,这种交叉可能导致协同和拮抗两种结果。因此,比较研究不同胁迫条件下玉米响应的分子机制,进一步解析这些响应机制之间的差异及相互作用,有利于解析玉米响应胁迫因子的分子调控网络,最终为玉米遗传改良提供参考。玉米作为我国第一,大粮食作物,在保障粮食安全、促进经济发展过程中具有重要作用。西南地区是中国第三大玉米主产区,其独特的地理和气候环境导致玉米在生长发育过程中受到多种生物及非生物胁迫,严重制约西南地区玉米生产发展。本研究在课题组前期研究的基础上,对西南地区玉米生产过程中受到三种重要胁迫类型展开研究,包括低氮、重金属镉及穗粒腐病菌胁迫。利用比较转录组学策略及分子生物学手段对不同玉米材料的胁迫响应机制展开研究,构建基因表达调控网络,挖掘并鉴定重要的胁迫响应候选基因,初步揭示玉米响应上述胁迫因子的调控机制及交叉互作关系,获得具有一定应用价值的基因资源和重要功能基因,为后期培育综合性状优良的玉米品种奠定理论基础和材料基础。本研究获得主要研究结果如下:1.为了揭示玉米对禾谷镰刀菌的抗性机制,在课题组前期研究基础上,本研究对人工接菌48 h、72 h和96 h后的抗玉米穗粒腐病材料IBM_81和感病材料IBM_85的花丝组织进行取样测序,鉴定差异表达基因。在6个比较组中共检测到5760个差异表达基因。其中仅有6个共表达差异基因,功能注释结果显示这些差异基因与防御响应相关。其中,位于基因间隔区的一个长非编码RNA(lincRNA)在病菌胁迫后显著上调表达,可能参与了玉米对禾谷镰刀菌的胁迫响应。差异表达基因功能富集分析结果表明差异表达基因在防御响应、植物激素信号转导、植物与病菌互作、苯丙烷合成通路中显著富集。在感病材料IBM_85中,光合作用相关的基因在72 h表达受到病菌胁迫的抑制,而这种抑制作用在抗病材料IBM_81中96 h才出现。对植物信号转导通路分析发现,JA应答通路负向调控因子ZmJAZs在抗、感材料中表达差异显著。抗病材料中ZmJAZs成员表达量较低,利于激活JA应答通路,提高植株抗性。另有ZmOPR1、ZmOPR2和ZmOPR5也参与了玉米对禾谷镰刀菌的胁迫响应。2.病程相关蛋白 PR1家族成员在丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路、植物激素信号通路和植物与病原菌互作中均具有重要作用。本研究在玉米中共鉴定出12个具有典型结构域的PR1基因家族成员。转录丰度变化表明4个编码PR1蛋白的基因在玉米花丝及苞叶中参与了禾谷镰刀菌胁迫响应。其中,ZmPR1-11在苞叶中大量表达,且在感病材料中具有更高的表达丰度,该基因可能具有广谱抗性。3.为探究玉米抵御低氮胁迫的响应机制,本研究在不同氮素处理、不同时间点(12 h、24 h、48 h、96 h)对玉米根系突变体rtcs及野生型的根系形态和生理变化进行研究。结果表明,低氮胁迫抑制供试材料谷氨酰胺合成酶活性,降低总蛋白含量;玉米初生根长度及侧根总长在低氮胁迫下均增长,且突变体变化更为明显。上述结果表明,在低氮条件下突变体rtcs能够通过初生根延长及侧根补偿性生长弥补其种子根、茎生根缺失导致的氮素吸收缺陷。4.利用比较转录组学方法对突变体rtcs与野生型在不同时间点、不同氮素水平处理下转录水平动态变化进行比较分析,共鉴定出786个与根系发育相关的共表达基因,这些基因参与了不同的生物学过程。其中ZmJA27和bHLH103在突变体中表达丰度较低,且在低氮胁迫后上调表达。共表达类群建立及顺式调控元件分析结果表明,AP2-EREBP转录因子家族成员在依赖于rtcs的调控网络中具有重要作用。本研究进一步鉴定出403个具有不同生物学功能的共表达基因参与了低氮胁迫响应。比较分析结果揭示出控制植物根系发育的调控网络影响低氮胁迫响应基因的表达。AUX/IAA-ARF-LBD-bHLH-AP2-EREBP和JAZ介导的JA应答通路调控模块在维持玉米根系发育与低氮胁迫响应之间的平衡中可能具有重要作用。5.基于课题组前期研究结果,本研究采用比较转录组学的方法检测玉米自交系B73、Mo17在重金属镉胁迫下的转录水平变化,以揭示玉米响应重金属镉胁迫的基因表达调控网络。基因差异表达分析共鉴定出在不同材料、不同胁迫时间点共表达差异基因115个,主要包括胁迫响应蛋白、转运蛋白及转录因子等,如ZmNAC70、ZmRAN1、ZmJAZs和ZmOPRs。共表达网络构建共鉴定出12个共表达模块,不同共表达模块中的基因参与了不同的生物学过程。值得注意的是,部分重金属胁迫响应基因参与了其它类型的生物及非生物胁迫响应过程,如ZmJAZs及ZmOPRs。6.基于转录组数据分析的结果,本研究进一步对OPR蛋白家族成员在响应镉胁迫过程中的功能进行研究。在玉米基因组中共鉴定出8个OPR家族成员。其中ZmOPR5编码OPR Ⅰ类蛋白,在镉胁迫下被显著诱导表达。亚细胞定位结果表明其蛋白定位于细胞膜。在镉胁迫条件下,ZmOPR5的拟南芥同源突变体αtopr2的根系生长受到明显抑制,表现出镉敏感的表型。上述结果表明OPR蛋白家族成员在玉米根系响应镉胁迫过程中具有不同的生物学功能,OPRⅠ类蛋白可能具有抵御氧化胁迫、细胞解毒的功能。其中ZmOPR5可能通过其在镉胁迫响应中类似的作用机制参与禾谷镰刀菌毒素转运或者转化,降低毒素对细胞的伤害。ZmOPR2同样也具有功能多样性,参与了镉胁迫及禾谷镰刀菌响应过程,其编码的蛋白质的底物特异性决定位点氨基酸不同于ZmOPR5,表明其可能具有与ZmOPR5不同的功能。7.本研究针对上述胁迫响应过程中的差异表达基因比较发现,一些重要的功能基因参与了多种胁迫响应过程。ZmJAZ7同时参与了根系发育、低氮胁迫、Cd胁迫及禾谷镰刀胁迫响应过程,其可能通过对JA应答通路的调节平衡生长发育和胁迫响应,以使植株适应多种逆境环境,保证植株正常生长发育。转录因子在调节生长发育及胁迫响应过程中具有重要作用,本研究中鉴定出多个AP2-EREBP家族成员参与了根系发育及胁迫响应。ZmOPR2和ZmOPR5通过独立于JA合成通路的途径同时参与了镉胁迫及禾谷镰刀胁迫响应,且两者对其他病菌的入侵也具有防御作用,可能具有较广的抗性。ZmPR1-2和ZmPR1-11的主要表达部位不同,分别参与了花丝和苞叶中的禾谷镰刀菌胁迫响应过程。上述结果表明玉米的生物及非生物胁迫响应调控通路存在交叉,进一步解析上述重要功能基因在多种胁迫响应过程中的功能及胁迫响应通路之间的互作,将为作物遗传改良提供更为全面的信息,利于培育优良的抗逆新品种。
【图文】：

突变体,野生型,根系,低氮胁迫

根上侧根总长（LRL）为主要研究指标，这两个指标能够较好的反应出两个材料在不同氮水平条件下的差异情况。根系形态分析结果显示，，在种子萌发后 8d天时突变体及野生型根系表现出显著形态差别，突变体中缺失种子根（图3.1A）。在正常氮水平条件下，突变体的 PRL、 LRL 长于野生型。随着生长时间延长，这种差距持续增大（图 3.1B）。前人发现植物初生根及其侧根对于植物早期定植土壤及吸收营养元素十分重要，两者的增长利于植物在低氮条件下吸收氮素[125]。在根系生长受到限制的情况下，植物可以通过改变剩余根系的表型来增加氮吸收，而不是通过增加氮吸收比率的方式[126]。在低氮胁迫条件下，两个材料的 PRL、 LRL 均呈现出增大的趋势，而突变体的 LRL 相较于野生型变化更大（图 3.1B）。为比较根系变化对氮素吸收利用率的影响

共表达,类群,突变体,差异表达基因

为了更加深入的研究依赖于 rtcs 的根系发育相关的调控网络，研究将所有显著差异表达的 DEGs 依据其动态表达模式进行 SOTA 聚类分析，最终 7418DEGs 被划分至 11 个共表达类群，表征根系发育过程中基因表达的变化（图3.5A）。其中，共表达类群 9-11 在野生型中表达量显著高于突变体，表明这些基因与依赖于 rtcs 的根系发育相关的调控网络紧密相关（图 3.5B）。针对这三个共表达类群中的 DEGs 进一步进行启动子区域顺式调控元件分析，均鉴定出ABI4 （MA0123.1）和 ERF1 （MA0567.1, 图 3.5B）转录因子结合位点，而ABI4 及 ERF1 转录因子都属于 AP2-EREBP 转录因子家族，该转录因子家族参与调控了许多重要的生物学过程，例如，植物营养生长与生殖发育、细胞增殖、激素信号转导、生物及非生物胁迫响应等。在上述共表达类群中共鉴定出 27 个AP2-EREBP 家族基因。上述结果表明 AP2-EREBP 转录因子家族成员在依赖于rtcs 的根系发育相关的调控网络中的具有重要功能。表达量热图显示出这 27 个AP2-EREBP 家族基因在突变体与野生型呈现差异性表达，且在野生型中平均表达量明显高于突变体中的表达量（图 3.5C）。
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S513

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