玉米雄性不育基因ms39精细定位及生长发育相关基因的遗传转化

发布时间：2020-04-03 02:00

【摘要】：玉米是用于粮食、饲料和生物燃料的重要作物,提高产量和生物量在玉米研究中有重要的意义。由于玉米杂种优势明显,而雄性不育是植物生殖生长过程中的一种常见表型,在玉米杂种优势利用上具有重要的应用价值,因此长期以来受到遗传育种工作者的广泛重视。另外,植物生长发育中营养生长是生殖生长的先决条件。植物营养生长可以分为幼年期(juvenile stage)和成年期(adult stage)两个阶段,由幼年期营养生长到成年期营养生长过渡的过程称为营养生长时相转变(vegetative phaseegetative phase change)。营养生长时相转换是一个复杂的过程,可能受到多个基因的调控,对后期的生殖生长时相转变(reproductive phase change)有重要的影响,在玉米生产上具有一定的指导意义。本论文的研究工作包含两个部分,一是关于玉米雄性不育基因ms39的精细定位,二是关于两个玉米营养生长时相转换相关基因的遗传转化。前期实验室通过太空诱变得到一份玉米雄性不育突变体,命名为ms39。本研究主要是对ms39进行精细定位及相关研究。首先对突变体的表型进行鉴定及花药进行细胞学观察。利用(ms39×Mo17)F_2群体1073株不育植株作为定位群体,通过不断寻找和开发新的分子标记对ms39进行精细定位,对定位区间内的12个候选基因进行克隆测序及序列比对分析,根据候选基因序列中的差异位点设计基因内分子标记验证定位结果。主要结果如下:(1)利用统计分析方法,进一步分析了不同育性分离群体中可育植株和不育株的株高、穗位高、雄穗分枝数、穗长、茎粗等性状差异,发现不育植株均显著低于可育株。(2)通过石蜡切片技术对小孢子发育过程进行细胞学观察,发现ms39突变体花药发育异常主要是从减数分裂二分体时期开始,二分体开始自溶,绒毡层细胞排列不规则,最终导致四分体不能形成小孢子。(3)通过不断开发新的分子标记,利用(ms39×Mo17)F_2的群体1073株不育株进行精细定位,最终将ms39定位在标记L7和M30之间,两者物理距离为365kb。在365kb的定位区间内,开发了两个基因内分子标记ARF12-3-2和NACTF82,最终将ms39基因定位在L7和NACTF82之间,物理距离为319kb。(4)在标记L7和NACTF82之间,预测10个候选基因,克隆测序分析10个基因的CDS区序列。结果表明:不育突变体中Zm00001d043909Cals12基因在编码区存在4个碱基的缺失。(5)根据候选基因Zm00001d043909Cals12在不育植株和可育株间的序列差异位点,设计引物InDel-cals,分别对(ms39×B73)BC_2F_2群体中117株不育单株,(ms39×Mo17)BC_4F_2群体320株不育单株,(ms39×Mo17)BC5F2群体中340株不育单株及姊妹交群体中170株不育单株进行分析,结果发现InDel-cals标记均未检测到交换单株,说明在以上供试群体中Zm00001d043909Cals12基因与ms39表现为完全连锁。(6)相对于正常可育株,突变体ms39在候选基因Zm00001d043909Cals12的编码区有4个碱基的缺失,利用DNAman软件预测其编码蛋白序列,结果表明4个碱基的缺失会导致Cals12基因翻译蛋白提前终止,使Cals12蛋白功能异常。前期通过生物信息学分析得到了两个可能控制玉米营养生长时相转换的基因ZmNF-YA-10(Nuclear factor,具有CCAAT位点)和一个未注释的基因ZmNovel-TF。为了了解这两个基因的功能,分别构建了2个基因的干涉载体pANIC8D-ZmNF-YA-10-RNAi、pANIC8D-ZmNovel-TF-RNAi。通过农杆菌介导,转入玉米Hi-II幼胚中。比较后代转基因植株和非转基因植株最后具有蜡质层的叶片(last leaf with epicuticular wax,LLEW)和总叶片数之间差异。主要结果如下:(1)经统计分析,转pANIC8D-ZmNF-YA-10-RNAi植株的T1代LLEW、叶片总数均显著高于非转基因植株(7.63±0.49 VS 7.29±0.25,P0.05,15.28±1.41 VS14.67±0.21,P0.05)。温室种植T2代的转基因植株的LLEW平均值显著高于非转基因植株(6.91±0.0015 VS 6.61±0.007,P(0.05)。上述结果表明,转pANIC8D-ZmNF-YA-10-RNAi植株一定程度上延长了玉米营养生长时相转换的时间。(2)比较T1代ZmNovel-TF-RNAi的转基因植株和非基因植株的LLEW、叶片总数等性状。结果表明转基因植株的LLEW和叶片总数与非转基因的LLEW、叶片总数均无显著差异。温室种植T2代的转基因植株LLEW与非转基因的LLEW同样无显著差异。综上所述,本研究将ms39基因定位在分子标记L7和NACTF82之间,两者相距319kb。基于候选基因的克隆测序和序列比对分析,推测Cals12可能是ms39关键候选基因,为下一步克隆该基因奠定了基础。Cals12是一个编码胼胝质合成酶基因,胼胝质在花药发育中扮演着重要角色。所以,ms39不育基因的研究丰富了玉米雄性不育资源及调控代谢途径。利用RNAi技术,发现干涉ZmNF-YA-10基因,LLEW的平均值在转基因植株和非转基因植株中差异显著,说明ZmNF-YA-10基因可能与玉米营养生长转换有关。干涉ZmNovel-TF基因,在转基因和非转基因植株后代中LLEW平均值无显著差异。
【图文】：

过程图,拟南芥,阶段,过程

拟南芥花药发育过程(Ma2005)Fig.1-1AntherdevelopmentprocessinArabidopisis(Ma2005)

过程图,玉米自交系,过程,绒毡层

四川农业大学博士学位论文5胞分化明显，性母细胞进入第一次减数分裂晚前期。图1-3-B是花药单个小室的横切面，相当于图1-3-A中长度为250μm的花药，图1-3-C相当于图1-3-A中700μm的花药；图1-3-D四层体细胞包围了中央性母细胞（减数分裂前），绒毡层细胞核以单核形式存在；图1-3-E绒毡层细胞变成双核，中层细胞开始降解，性母细胞处于终变期，胼胝质在小孢子囊中心积累，图1-3-F，花粉母细胞减数分裂形成四分体；图1-3-G，中层细胞（ML）和绒毡层开始降解(Timofejeva et al. 2013)。图1-3玉米自交系B73花药发育过程(Timofejeva et al. 2013)Fig. 1-3Anther development process of maize inbred line B73 (Timofejeva et al. 2013)L1-d:表皮（红色）；L2-d：L2细胞（黄色）；EN:内层；ML:中层；TA：绒毡层；AR:孢原细胞；Me：性母细胞；SPC：次生壁细胞L1-d: epidermis (red); L2-d: L2-d cells (yellow); EN: endothecium; ML: middle layer; TA: tapetal layer;AR: archesporial cell; Me: meiocytes; SPC: secondary parietal cells.Ma等人研究玉米花药长度和时期有一定的关系(Ma et al. 2008)
【学位授予单位】：四川农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S513

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