拟南芥AKR2A基因转化棉花对棉籽油组分的影响
发布时间：2020-04-04 21:05
【摘要】：棉花是世界上重要的经济作物,也是我国十大油料作物之一。中国虽是产棉大国,但棉籽加工仍然存在加工规模小和技术落后的问题。棉籽油作为一种清洁的可再生能源,是良好的生物柴油原料。因此,在不影响棉花产质量的前提下,提高棉籽油的含量,改善棉籽油脂肪酸组分成为棉花育种新的切入点。此外,棉纤维品质单一和低下已成为棉花产业发展的瓶颈,提升棉纤维质量迫在眉睫。AKR2A(ankyrin repeat-contain protein 2A)是一个高效伴侣蛋白,研究发现,AKR2A与KCS1存在互作关系,能够调控超长链脂肪酸(Very-long-chain fatty acids,VLCFAs)合成,从而提高棉籽油含油量和脂肪酸组成,而VLCFA是调控棉纤维发育的一条重要途径,并能提高棉纤维长度。本文利用基因工程技术将拟南芥AKR2A基因转入棉花中,最终获得高表达棉花转基因株系AKR2A-2,AKR2A-57;分析转基因棉花植株的农艺学性状,并对转基因棉花种子进行含油量、脂肪酸组分分析以及脂肪酸合成相关基因表达量分析;利用酵母双杂交和模式植物拟南芥筛选AKR2A互作蛋白KCS1;同时分析AKR2A、KCS1单基因过表达植株和双基因过表达植株含油量、脂肪酸组分变化和脂肪酸合成相关基因表达量变化。主要结果如下。1.利用根癌农杆菌转化法侵染棉花下胚轴,将拟南芥AKR2A基因转入棉花,离体培养获得再生植株。通过PCR鉴定、实时荧光定量PCR鉴定和Western blot鉴定,最终获得高表达棉花转基因纯系AKR2A-2和AKR2A-57。2.利用索氏提取法分析转基因棉花植株AKR2A-2和AKR2A-57种子不同发育时期含油量,发现20-30 d棉花开花发育时期是种子油含量的快速增长期,以野生型棉花为对照,从25 d开始,转基因棉花种子含油量显著高于野生型植株,30 d时,转基因植株含油量比野生型提高33%,转基因棉花植株AKR2A-2和AKR2A-57成熟种子含油量分别比野生型提高8.40%和11.19%。通过比较成熟种子油脂色泽发现,转基因棉花植株成熟种子油脂色泽较野生型深。3.利用气相色谱分析棉花种子不同发育时期脂肪酸组分的变化,发现转基因植株VLCFA含量在各时期均高于野生型,15 d时,转基因植株比对照提高近一倍,超长链与长链脂肪酸比例也有相同趋势。4.利用实时荧光定量PCR分析脂肪酸合成相关基因表达量在棉花种子不同发育时期的差异发现,与野生型相比,转基因棉花植株种子脂肪酸合成相关基因表达量在各个阶段都有不同程度的提高,15-20 d时各基因表达量达到最高。ECR1基因在15-20 d种子中表达趋势上升明显,最高时达到对照Coker的1.3倍左右,FAD2-1基因在种子的发育过程中基因表达量显著提高,且在AKR2A转基因植株中一直保持高表达状态。5.分析转基因棉花的农艺学性状发现,转基因棉花植株的棉纤维和棉籽产量显著高于野生型。与野生型相比,转基因棉花发育各个时期,棉纤维长度都有不同程度的提高,棉纤维发育15d时,AKR2A转基因棉花的棉纤维长度比对照Coker提高最多,达5 mm左右。6.通过酵母双杂交筛选到AKR2A互作的拟南芥蛋白KCS1,通过免疫共沉淀验证了 AKR2A与KCS1在拟南芥体内的真实互作关系。7.利用实时荧光定量PCR分析AKR2A基因过表达拟南芥植株中部分KCS家族基因的表达量发现,与野生型植株Col-0相比,AKR2A单基因过表达植株的KCS家族基因表达量上调;分析AKR2A、KCS1单基因过表达拟南芥植株和双基因过表达拟南芥植株种子含油量发现,三种转基因拟南芥植株种子含油量均不同程度高于野生型;分析AKR2A、KCS1双基因过表达拟南芥植株脂肪酸组分变化发现,双基因过量表达植株种子的VLCFA含量比野生型提高24.7%,占总脂肪酸比例提高25.97%。
【图文】：
ＡＫＲ２Ａ蛋白包含四个在Ｃ端的亮氨酸重复序列，和一个Ｎ端的ＰＥＳＴ区域［２９］，逡逑该ＰＥＳＴ结构域序列为一富含脯氨酸（Ｐ）、谷氨酰胺（Ｅ）、丝氨酸（Ｓ）、苏氦酸（Ｔ）逡逑的约１０个氨基酸组成的结构序列，ＡＫＲ２Ａ的结构示意图如图１－１Ｗ３２’３４］所示。在对逡逑ＡＫＲ２Ａ研宄时，研宄人员发现ＡＫＲ２Ａ的亮氨酸重复序列在其与底物蛋白的相互作逡逑用中没有关键的作用，减去这段序列后不影响ＡＫＲ２Ａ与底物蛋白的相互作用。逡逑（＾ＯＩＶｉｒＴ＾）逦Ｅ３邋Ｌｉｇａｓｅ逦（＾ＡＰＸ３＾）逡逑Ｈａｖｏｉｄ逦Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍａｌ逡逑ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ逦逦逦＿逦Ｈ２0２邋ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ逡逑＾邋Ｓｃａｆｆｏｌｄ邋ｐｒｏｔｅｉｎ逦逦逡逑ＣｊＴＯＰｌＪ）逦（１４－３－３邋ｐｒｏｔｅｉｎ）逦（＾ＡＫＲ２Ａ＾逡逑Ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ逦Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ邋ｐｒｏｔｅｉｎ逡逑（ｏｒ邋ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ邋ｆｕｎｃｔｉｏｎ）逦＾逡逑１邋Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ邋ｓｉｇｎａｌ逦３邋１２逡逑Ａｎｋｙｒｉｎ邋ｒｅｐｅａｔｓ逡逑图１－１伴侣蛋白ＡＫＲ２Ａ结构示意图逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ邋Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ邋ＡＫＲ２Ａ逡逑进一步研究表明，除了邋ＡＰＸ３之外，ＡＫＲ２Ａ与叶绿体膜蛋白ＴＯＣ３４，过氧化物逡逑酶膜蛋白ＡＰＸ５，微粒体膜蛋白ＣＢ５－Ｂ和ＣＢＲ，及线粒体膜蛋白ＴＯＭ２０等都有互作逡逑关系１３５１。进一步研究发现，，ＡＫＲ２Ａ作用于膜蛋白的特殊信号序列，ＡＢＳ信号序列逡逑（ＡＫＲ２Ａ－ｂｉｎｄｉｎｇ邋Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）１３１’３２’３４１
游离脂肪酸被运到内质网或细胞质基质中进一步加工［６３，Ｍ］，一条途径是碳链脱饱逡逑和，生成多不饱和脂肪酸，另一条途径是碳链延长，生成ＶＬＣＦＡ。ＶＬＣＦＡ的合成是逡逑脂肪酸合成第二阶段，如图１－４［６５］所不。由脂肪酸碳链延长酶（ＦａｔｔｙＡｃｉｄＥｌｏｎｇａｓｅ）逡逑催化完成，以质体中合成的１６Ｃ或１８Ｃ脂肪酸为底物，以丙二酰－ＣｏＡ为２Ｃ供体，逡逑经过四步延伸反应，脂酰－ＣｏＡ首先和丙二酰－ＣｏＡ在３－酮脂酰－ＣｏＡ缩合酶（ＫＣＳ）逡逑催化下生成３－酮脂酰－ＣｏＡ，然后，在３－酮脂酰－ＣｏＡ还原酶（ＫＣＲ）作用下还原成３－逡逑羟脂酰－ＣｏＡ，经过３－羟脂酰－ＣｏＡ脱水酶（ＨＣＤ）脱水生成烯脂憸－ＣｏＡ，最后经过烯逡逑脂酰－ＣｏＡ还原酶（ＨＣＲ）还原，在脂肪酸碳链末端添加２个碳原子。合成的ＶＬＣＦＡ逡逑作为蜡质合成的前体物质分别进入酰基还原途径或脱羰基途径｜６６］。逡逑ＰＬ；ＡＳ７７Ｄ、逡逑ｉｆｌ邋Ｆａｔｔｙ邋Ａｄｄ逦ＩｊＢ邋Ｃ１８邋－邋Ｃ２０邋？邋Ｃ２２邋？邋Ｃ２４邋？邋Ｃ２６邋Ｃ２８邋？邋Ｃ３０邋－邋Ｃ３２邋？邋Ｃ３４逡逑Ｓｙｎｔｈａｓｅ邋（ＦＡＳ）逡逑Ｖ逦Ｃ１６邋Q咤澹茫绣危巍五义希埽茫保福粒茫绣澹危惧澹遥牛模眨茫裕桑希五义希耄悖箦澹ㄥ危疲幔簦簦澹粒悖椋溴巍ⅲ瑁悖溴义希茫保叮
本文编号：2614073
【图文】：
ＡＫＲ２Ａ蛋白包含四个在Ｃ端的亮氨酸重复序列，和一个Ｎ端的ＰＥＳＴ区域［２９］，逡逑该ＰＥＳＴ结构域序列为一富含脯氨酸（Ｐ）、谷氨酰胺（Ｅ）、丝氨酸（Ｓ）、苏氦酸（Ｔ）逡逑的约１０个氨基酸组成的结构序列，ＡＫＲ２Ａ的结构示意图如图１－１Ｗ３２’３４］所示。在对逡逑ＡＫＲ２Ａ研宄时，研宄人员发现ＡＫＲ２Ａ的亮氨酸重复序列在其与底物蛋白的相互作逡逑用中没有关键的作用，减去这段序列后不影响ＡＫＲ２Ａ与底物蛋白的相互作用。逡逑（＾ＯＩＶｉｒＴ＾）逦Ｅ３邋Ｌｉｇａｓｅ逦（＾ＡＰＸ３＾）逡逑Ｈａｖｏｉｄ逦Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍａｌ逡逑ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ逦逦逦＿逦Ｈ２0２邋ｓｃａｖｅｎｇｉｎｇ逡逑＾邋Ｓｃａｆｆｏｌｄ邋ｐｒｏｔｅｉｎ逦逦逡逑ＣｊＴＯＰｌＪ）逦（１４－３－３邋ｐｒｏｔｅｉｎ）逦（＾ＡＫＲ２Ａ＾逡逑Ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ逦Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ邋ｐｒｏｔｅｉｎ逡逑（ｏｒ邋ｐｒｏｔｅａｓｏｍｅ邋ｆｕｎｃｔｉｏｎ）逦＾逡逑１邋Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ邋ｓｉｇｎａｌ逦３邋１２逡逑Ａｎｋｙｒｉｎ邋ｒｅｐｅａｔｓ逡逑图１－１伴侣蛋白ＡＫＲ２Ａ结构示意图逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ邋Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ邋ＡＫＲ２Ａ逡逑进一步研究表明，除了邋ＡＰＸ３之外，ＡＫＲ２Ａ与叶绿体膜蛋白ＴＯＣ３４，过氧化物逡逑酶膜蛋白ＡＰＸ５，微粒体膜蛋白ＣＢ５－Ｂ和ＣＢＲ，及线粒体膜蛋白ＴＯＭ２０等都有互作逡逑关系１３５１。进一步研究发现，，ＡＫＲ２Ａ作用于膜蛋白的特殊信号序列，ＡＢＳ信号序列逡逑（ＡＫＲ２Ａ－ｂｉｎｄｉｎｇ邋Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）１３１’３２’３４１
游离脂肪酸被运到内质网或细胞质基质中进一步加工［６３，Ｍ］，一条途径是碳链脱饱逡逑和，生成多不饱和脂肪酸，另一条途径是碳链延长，生成ＶＬＣＦＡ。ＶＬＣＦＡ的合成是逡逑脂肪酸合成第二阶段，如图１－４［６５］所不。由脂肪酸碳链延长酶（ＦａｔｔｙＡｃｉｄＥｌｏｎｇａｓｅ）逡逑催化完成，以质体中合成的１６Ｃ或１８Ｃ脂肪酸为底物，以丙二酰－ＣｏＡ为２Ｃ供体，逡逑经过四步延伸反应，脂酰－ＣｏＡ首先和丙二酰－ＣｏＡ在３－酮脂酰－ＣｏＡ缩合酶（ＫＣＳ）逡逑催化下生成３－酮脂酰－ＣｏＡ，然后，在３－酮脂酰－ＣｏＡ还原酶（ＫＣＲ）作用下还原成３－逡逑羟脂酰－ＣｏＡ，经过３－羟脂酰－ＣｏＡ脱水酶（ＨＣＤ）脱水生成烯脂憸－ＣｏＡ，最后经过烯逡逑脂酰－ＣｏＡ还原酶（ＨＣＲ）还原，在脂肪酸碳链末端添加２个碳原子。合成的ＶＬＣＦＡ逡逑作为蜡质合成的前体物质分别进入酰基还原途径或脱羰基途径｜６６］。逡逑ＰＬ；ＡＳ７７Ｄ、逡逑ｉｆｌ邋Ｆａｔｔｙ邋Ａｄｄ逦ＩｊＢ邋Ｃ１８邋－邋Ｃ２０邋？邋Ｃ２２邋？邋Ｃ２４邋？邋Ｃ２６邋Ｃ２８邋？邋Ｃ３０邋－邋Ｃ３２邋？邋Ｃ３４逡逑Ｓｙｎｔｈａｓｅ邋（ＦＡＳ）逡逑Ｖ逦Ｃ１６邋Q咤澹茫绣危巍五义希埽茫保福粒茫绣澹危惧澹遥牛模眨茫裕桑希五义希耄悖箦澹ㄥ危疲幔簦簦澹粒悖椋溴巍ⅲ瑁悖溴义希茫保叮
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