人参PgPMEI09基因的克隆及转化胡萝卜干细胞的研究

发布时间：2020-04-04 22:06

【摘要】：果胶甲酯酶(PME)广泛存在于细菌、真菌以及高等植物中,可以催化甲酯化的果胶产生去酯化作用,果胶甲酯酶抑制剂(PMEI)能够特异性的抑制植物中PME的脱酯化作用。本实验室前期研究发现,PMEI可能参与人参皂苷合成的调节,但是相关研究未见报道。胡萝卜与人参亲缘关系较近,培养方式简单。类胡萝卜素与人参皂苷的合成都是以异戊烯基焦磷酸(IPP)作为前体,且植物干细胞具有旺盛的分裂能力和较高的遗传稳定性,能维持稳定的增殖速度。所以可以利用胡萝卜干细胞为受体材料,研究人参皂苷合成相关基因的功能。鉴于以上基础,本研究以吉林人参248,993 Unigenes数据库为基础,从中筛选出吉林人参PgPMEIs。在系统分析的基础上,根据分析结果从中选择1条吉林人参PgPMEI基因序列克隆目的基因并构建表达载体,以胡萝卜干细胞为受体,进行异源受体的转化,从而研究目的基因的功能。取得的结果如下:1.从吉林人参14个组织器官248,993转录组序列数据库中筛选出12条PgPMEIs。GO注释结果显示,在Level-2水平下,分别注释到分子功能调节剂和生物调节方面。富集分析显示,在生物调节方面具有极显著差异。2.PgPMEIs与外源物种系统进化分析表明,PgPMEIs在进化上晚于胡萝卜,且具有良好的保守性;3.12条PgPMEIs氨基酸序列比对以及保守motif预测结果表明,PgPMEIs含有4个保守的Cys,和一段保守的SNAL氨基酸区段;4.PgPMEIs与皂苷生物合成关键酶基因之间的互作关系说明基因不是独立存在,而是以集群的形式存在,相互协作,形成复杂的调控网络,共同参与植物生长发育过程。并且在12条PgPMEIs中,PgPMEI09与各基因之间互作关系最紧密,连线数为8条;5.表达模式分析表明,PgPMEIs在人参中的表达不受农家品种的影响。4个年生根中PgPMEIs的表达随着参龄的增加而增加。14个组织部位中PgPMEIs表达模式表明,果茎中表达的基因最多,为11条,茎中表达的基因最少,为6条。12条PgPMEIs中有4条基因在14个组织器官都参与表达,其分别为PgPMEI02、PgPMEI09、PgPMEI11和PgPMEI12;6.在上述分析结果的基础上,筛选出PgPMEI09,克隆了该基因并构建了表达载体;7.利用农杆菌介导法转化拟南芥,观察T_2代拟南芥和野生型拟南芥。结果表明,转后拟南芥抽苔时间和开花时间都比野生型延后,转化后拟南芥果荚长度以及每个果荚的籽粒数都降低,种子的千粒重无显著变化,与野生型拟南芥相比转化后拟南芥植株PME活性降低;8.成功诱导胡萝卜根形成层干细胞系并建立了再生体系。结果表明:WPM+IBA4mg/L培养基对胡萝卜干细胞的诱导效果最好,诱导率为91.33%;MS+2,4-D 2 mg/L+IBA0.2 mg/L+KT 0.5 mg/L培养基的增殖效果最好;干细胞接种于MS基础培养基,在25℃条件下,16 h光照、8 h黑暗交替培养,再生率为95.5%,愈伤组织的再生率为89.25%。生理生化指标测定结果表明,干细胞的可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、类胡萝卜素含量以及过氧化物酶(POD)活性均高于愈伤组织细胞;9.利用农杆菌介导法转化胡萝卜干细胞和愈伤组织,干细胞的转化率为39.64%,愈伤组织的转化率为31.29%。对转化后的胡萝卜干细胞和愈伤组织的可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、PME活性以及过氧化物酶(POD)活性测定结果显示,与转化前相比,可溶性糖含量、可溶性蛋白含量以及PME活性均有不同程度的降低,而POD活性升高。本研究为进一步开展人参功能基因的研究提供了参考。
【图文】：

2.2.3.3 拟南芥阳性植株的检测对转化后的 T2代拟南芥进行 PCR 检测。设计 3 对引物，针对目的基因开放阅读框内中间序列设计上下游引物进行 PCR 检测，，扩增产物命名为 A 片段；针对 35S 启动子与目的基因连接处设计上游引物与 A 片段的下游引物进行 PCR 检测，扩增产物命名为 片段；针对 GUS 基因与目的基因连接处设计下游引物与 A 片段上游引物进行 PCR 检测扩增产物命名为 C 片段。引物设计如表 2-15 所示，A、B、C 片段如图 2.1 所示。

到的 GO Term 进行富集分析。3.1.2.1 吉林人参 PgPMEIs 物种注释分析吉林人参12条PgPMEIs序列注释到的信息在不同物种中的分布如图3.1。其中包括：胡萝卜（Daucus carota subsp. Sativus）、樟子松（Olea europaea var. sylvestris）烟草（Nicotiana tabacum）、芝麻（Sesamum indicum）、美花烟草（Nicotiana sylvestris）、马铃薯（Solanum tuberosum）、野生烟草（Nicotiana attenuata）、紫花风铃木（Handroanthusimpetiginosus）、栓皮栎（Quercus suber）、黄灯笼辣椒（Capsicum chinense）、中粒咖啡（Coffea canephora）、毛果杨（Populus trichocarpa）、葡萄（Vitis vinifera）、灯笼辣椒（Capsicum baccatum）、番茄（Solanum lycopersicum）、猴面花（Mimulus guttatus）、茸毛烟草（Nicotiana tomentosiformis）、甜椒（Capsicum annuum）、野生种潘那利番茄（Solanum pennellii）等。其中在胡萝卜中注释到的序列条目最多为 27 条，占总条目的10.5%；其次为樟子松为 14 条，占总条目的 5.5%。
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S567.51

【参考文献】

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1 胡博华;徐R

本文编号：2614129