烟草侧分生组织形成相关基因（las,bl,rev）的基因编辑及功能研究

发布时间：2020-04-04 23:20

【摘要】：理想的植物株型塑造有利于提高作物产量,人们通过果树剪枝提高坐果率,通过增加水稻和小麦的分蘖数来提高产量。植物地上部分的形态主要由植物的分枝发育决定,植物的分枝发育主要经历三个阶段:首先是侧分生组织的起始,主要受遗传因子的调控;然后是腋芽的形成和腋芽的生长与休眠,主要由植物的发育进程、外界环境和一些植物激素(如生长素、细胞分裂素、独脚金内酯等)共同决定。烟草是一种以收获叶为生产原料的经济作物,它的株型单一,分枝方式为单轴分枝。在烟草的营养生长阶段,受顶端优势的抑制,其腋芽并不生长。当烟草由营养生长阶段转变为生殖生长阶段时,顶端优势减弱,且在烟草的实际生产中要对其进行打顶。烟草打顶后,顶端优势解除导致叶腋生长素浓度降低,而细胞分裂素浓度升高,促进了腋芽的生长,形成新的分枝。腋芽的生长不利于老叶营养物质的积累,会降低烟叶的商业价值,所以要对其进行抹芽。烟草的打顶抹芽是一项费时耗力的工作,基于此本研究希望通过CRISPR/Cas9基因编辑的方法对烟草侧分生组织形成的相关基因(las,bl,rev)进行敲除,以期获得打顶后腋芽减少生长的突变体,并进行相应的基因功能研究,对以后培育打顶后可自行抑芽的烟草品种提供理论基础。主要获得的研究结果如下:1.通过同源比对和蛋白功能域分析从烟草基因组中鉴定到9个HD-Zip Ⅲ转录因子家族成员,分别命名为NtHB1～NtHB9,其中NtHB6和NtHB9与rev的同源性最高,分别为79.88%和80.24%。通过同源比对和进化分析,从烟草基因组中鉴定到两个las的同源基因Ntlas1和Ntlas2。从NCBI上下载了烟草中bl的同源基因Ntrax1和Ntrax2。设计引物克隆了NtHB6/NtHB9,Ntlas1/Ntlas 和Ntrax1/Ntrax2的CDS序列并进行序列分析。2.根据目标基因的基因结构和CDS序列,每个基因设计了 3个编辑的靶位点,其中rev的第一个和第三个靶位点为NtHB9上的序列,第二个靶位点为NtHB6/NtHB9的共同序列;构建了单基因敲除载体和双基因敲除载体共计12个;通过农杆菌介导的遗传转化法侵染野生型烟草红花大金元叶片,经历愈伤诱导后获得再生植株;再生植株靶位点突变检测结果显示每个基因都成功获得了突变体,突变形式为碱基的删除、插入和替换,套袋自交获得T1代突变体。3.成功获得单基因敲除突变株7株,双基因敲除突变株5株。我们对其中的一些突变体进行了分析,突变位点分析结果显示:rev2-4和rev2-6都检测到了NtHB6/NtHB9双基因突变,碱基的删除和插入导致基因编码提前终止,蛋白结构域预测其不能形成MEKHLA结构域,而这个结构域是rev所属亚家族特有的结构域,它在蛋白二聚化过程中具有很重要的作用;rev1-3检测到了NtHB 单基因突变,碱基的删除使得氨基酸序列第34和35位出现氨基酸的删除和替换,蛋白结构域预测并未对蛋白编码产生较大影响;las2-1为单基因突变体,其碱基的删除导致基因编码提前终止。4.在获得的T1代突变体中,rev2-6突变表型明显,其纯合突变体顶芽发育缺陷,停留在两片子叶的发育状态,或顶端发育出数量不一的异形叶。异形叶的形状一般为圆形、喇叭状、不对称扇形,叶脉发育不完全。顶芽发育缺陷的突变株根基本不发育,顶端发育出异形叶的突变株能发育出少量根。Rev1-3的纯合突变体正常生长,且在打顶10天、20天、30天后腋芽生长数目较野生型并没有很大差异。Rev2-4均为杂合体,正常生长,但在打顶10天、20天、30天后腋芽的平均生长数目均低于野生型。5.通过突变体rev2-6的研究,对NtHB6/NtHB9影响烟草发育的多效性进行了分析。其影响包括以下几个方面:①对顶端分生组织的影响,顶芽发育缺陷,顶端分生组织发育相关基因表达量变化显著。②对非顶端分生组织的影响,异型叶表面生长出凸起的组织或叶状体,叶片厚度明显增加,单位叶面积重量增加。通过扫描电镜对突变体叶表面进行观察,发现叶片腺毛数量明显减少,表皮细胞明显增大。③对叶片发育的影响包括3个方面:首先是叶片不能建立正常的叶极性,发育出异形叶,且和叶片极性建立相关的基因表达量变化显著;其次是不能发育出完整的叶脉,叶脉维管束变小;最后叶片的代谢物质总糖、总蛋白、叶绿素、类胡萝卜素含量降低。
【图文】：

模型图,腋芽,发育阶段,模型

长主要是茎和侧枝的发育，茎由胚胎发育时期产生的顶端分生组织一直维持植株逡逑的向上生长而来，侧枝则由侧分生组织发育形成［５］。逡逑植物分枝起源于侧分生组织，其发育进程主要包括三个阶段（图１．２）：侧分逡逑生组织（ＡＭ）的起始，，腋芽的形成以及腋芽的生长与休眠［６］。侧分生组织的形成逡逑主要受一些遗传因子的调控，这些基因通过调控一系列和顶端分生组织以及侧分逡逑生组织形成相关基因的时空表达，来调控侧分生组织的起始。一般认为侧分生组逡逑织的起源有两种模式：一种模式认为它们源自叶原基，以及从顶端分生组织分离逡逑出来的具有分生特性的细胞。例如，番茄的兄（＆）突变体逡逑中，营养生长阶段腋芽发育缺陷，这是因为叶原基离开顶端时，其基部没有具有逡逑分生特性的细胞群不能形成分生组织［７］。另一种模式则认为腋生分生组织和顶端逡逑分生组织是独立存在的，发育中的叶基部细胞开始分化，在原基从顶端分生组织逡逑分离后

调控机制,植物激素,对顶,顶端分生组织

植物茎顶端分生组织（ＳＡＭ）是产生植物地上部分所有器官的源泉，包括叶、逡逑茎、侧枝、花序等顶端分生组织根据细胞分裂方向分为３层，即Ｌ１－Ｌ３，后期逡逑发育为不同的组织；根据位置和功能分为三个区域（图１．４），中心区（０Ｃ）由逡逑千细胞和组织中心组成，周边区（ＰＺ）分化成侧器官，肋状区（ＲＺ）位于组织中逡逑心下方，为茎的生长提供细胞［１７］。中心区千细胞衍生的细胞转换成周边区细胞，逡逑形成侧器官原基，进行器官的分化，而内周边区的细胞可以通过脱分化恢复到干逡逑细胞状态［１８］。尽管垄顶端分生组织的细胞处于不断分裂、分化的状态，但各个Ｋ逡逑域的细胞数目却保持着相对恒定的比例，维持着茎顶端的生长，这一过程需要细逡逑胞中各种基因表达的调控，同时形成一个维持稳态平衡的调控网络［１９，２＇逡逑４逡逑
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q943.2;S572

【参考文献】