翘嘴鳜IFN-α3基因的克隆表达及其多克隆抗体的制备

发布时间：2020-04-05 14:04

【摘要】：目的:干扰素(Interferons)是一种具有多功能活性的蛋白质,是当机体和细胞受到病毒或其它诱导剂刺激后,由淋巴细胞和单核细胞产生的一种细胞因子,能够诱导脊椎动物进入抗病毒状态。除了抗病毒作用外,它还参与其它重要的生理过程,如调节细胞的生长、分化、凋亡以及机体免疫反应等。鱼类是低等脊椎动物,非特异性免疫占有重要地位。IFN系统作为一种高效的非特异性免疫因子,在鱼体的抗感染免疫中发挥重要的作用。翘嘴鳜(Siniperca chuatsi)是中国重要的名优淡水养殖品种,随着养殖密度的提高,养殖病害愈发严重,由ISKNV引起的传染性脾肾坏死病的暴发,不仅带来巨大经济损失,还制约翘嘴鳜养殖业的发展。本研究旨在通过克隆翘嘴鳜IFN-α3基因,分析IFN-α3的表达模式,构建IFN-α3的原核表达载体,诱导表达出重组蛋白,制备特异性多克隆抗体,揭示经Poly I:C刺激后翘嘴鳜体内IFN-α3基因、IFN-α3蛋白的表达情况,为IFN-α3的功能研究奠定基础,对于鱼类病毒性疾病的防治研究具有重要的理论和实际意义。方法:运用RACE技术从翘嘴鳜中克隆IFN-α3全长c DNA,通过q PCR检测健康翘嘴鳜以及聚肌胞甘酸(Poly I:C)刺激下翘嘴鳜各组织中IFN-α3的相对表达量,采用p ET32a(+)原核表达系统表达IFN-α3重组蛋白,以割胶纯化的翘嘴鳜IFN-α3重组蛋白为免疫原,并以腹腔与皮下组织交替注射的方法免疫小鼠,制备抗翘嘴鳜IFN-α3的多克隆抗体。采用琼脂双扩散法和酶联免疫吸附(ELISA)技术检测抗体的效价,用免疫印迹(Western blot)技术检测抗体的特异性,最后运用Western blot分析聚肌胞甘酸(Poly I:C)刺激后翘嘴鳜各免疫相关组织中天然IFN-α3蛋白的表达特征。结果:翘嘴鳜IFN-α3 c DNA全长为863bp,包含一个537 bp的开放阅读框,编码长度为178个氨基酸的多肽,去除信号肽后,预测的分子量为18 k Da,氨基酸序列具有IFN-α3家族特征性序列。系统进化树分析结果显示,翘嘴鳜和其它鲈科鱼类的IFN-α3归为单独的一支。健康翘嘴鳜胸腺、头肾、鳃、脾脏、肝脏、肠、体肾、血共8种组织中IFN-α3 m RNA均有不同水平的表达,血、头肾、脾脏、胸腺中其转录水平相较其它组织高,经Poly I:C刺激鱼体后,IFN-α3转录水平在胸腺、头肾、脾脏、肝脏、体肾、血中显著上调;其中,肝脏在Poly I:C刺激3 h后IFN-α3上调达最高峰,胸腺于Poly I:C刺激后6h时表达量最高,头肾、脾脏分别在12 h、48 h时达最高峰。表达菌经IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE检测,结果显示重组蛋白大小为36 k Da,与预测大小相符。琼脂双扩散显示,所获多抗的效价为1:32,酶联免疫吸附(ELISA)结果显示,翘嘴鳜IFN-α3多克隆抗体效价可达1∶64000;Western blot结果显示,所制备的多克隆抗体可特异性识别原核表达的IFN-α3重组蛋白和翘嘴鳜体内天然IFN-α3蛋白。结论:我们克隆并鉴定了翘嘴鳜IFN-α3基因,分析了健康以及Poly I:C刺激下翘嘴鳜各组织中IFN-α3的表达模式,诱导表达出重组蛋白,制备并验证了抗翘嘴鳜IFN-α3多克隆抗体,该研究证实,经Poly I:C刺激后,翘嘴鳜体内表达出了IFN-α3蛋白。本研究为蛋白的原核表达和特异性多抗的制备及验证提供了研究思路,也为研究翘嘴鳜IFN-α3基因功能提供了特异性抗体,同时为鱼类IFN在鱼类病害防治上的开发和利用奠定了基础。
【图文】：

二聚化并且结合 IRF-9，激活 ISG 基因启动子上的 IFN 刺激反应元件(ISRE)。最后，，ISG 基因开始转录，从而使 IFN 邻近的细胞合成抗病毒蛋白。图-1 哺乳动物 IFN 信号通路（JAK-STAT 通路）图-2 IFN-α/β抗病毒作用的 2 步信号传导途径图

IFN-α/β抗病毒作用的2步信号传导途径图
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S917.4

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本文编号：2615112