【摘要】：目的:三萜皂苷是一类具有复杂结构的天然产物,是多种药用植物的主要药效活性物质,但是分离困难和人工合成步骤多、收率低等问题限制了这类成分的获取和开发利用,因此研究其微生物异源合成具有重要意义。我国南方常用中药毛冬青(Ilex ubescens)含有多种熊果烷型三萜皂苷类活性成分,后者共同的结构特征是C-28位甲基被氧化形成羧基。因此,本研究的目的是从毛冬青转录组中发掘与毛冬青三萜皂苷C-28位氧化修饰相关的关键酶——细胞色素P450单加氧酶(CYP)基因,并进行功能鉴定,为后续开展活性毛冬青三萜皂苷的微生物异源合成奠定基础。方法:1、CYPs候选基因的筛选以10个已鉴定的催化三萜C-28位氧化的CYPs作为比对分析对象,对毛冬青转录组数据进行本地BLAST分析,筛选同源性大于40%的CYPs候选基因;将候选出的CYPs和已知CYPs进行系统发生分析,根据遗传进化关系,从中筛选出可信度最高的C-28位三萜氧化酶候选基因。2、候选基因克隆和载体构建从毛冬青嫩叶中提取总RNA,反转录制备cDNA,通过PCR扩增获得候选基因。用In-FusionTM连接技术将候选基因及毛冬青三萜合酶基因IpAS1(课题组前期已获得)连接至同一酵母表达载体pJL的两个不同表达盒,获得带目的基因的酵母重组质粒。3、候选基因编码蛋白的表达与功能分析应用醋酸锂转染方法,将携带目的基因的酵母重组质粒转化到可以特异性表达拟南芥细胞色素P450还原酶(CPR)的酿酒酵母菌株S.cerevisiae WAT1l中,然后用2%半乳糖来诱导候选基因的表达,用Western Blot实验分析蛋白表达情况,用GC-MS检测代谢产物熊果酸和齐墩果酸。4、密码子优化与过表达tHMGR调控重组酵母中齐墩果酸和熊果酸的合成根据酿酒酵母对密码子的偏好性,优化目的基因密码子,同理构建酵母重组质粒,考察密码子优化对重组酵母合成熊果酸产率的影响。另一方面,通过质粒转化将萜烯生物合成途径中的主要限速酶3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMGR)引入重组酵母,增加酿酒酵母HMGR基因拷贝数,用GC-MS检测代谢产物熊果酸,并与相应的HMG整合进基因组的重组酵母、以及未转化HMGR的重组酵母进行比较。成果:1、毛冬青三萜C-28位氧化相关CYP候选基因通过序列分析,从毛冬青转录组中找到1个可能参与到毛冬青三萜的C-28位氧化的CYP基因(命名为IpAO1),该候选基因包含一个1437 bp的开放阅读框,可能编码一个478 aa的蛋白,催化熊果烷或齐墩果烷C-28位的氧化,生成相应的熊果酸和齐墩果酸。2、IpAO1 功能将带有IpAO1和IpAS1双基因的酿酒酵母重组质粒pJL-AS1+AO1转化至酵母菌株WAT11。Western Blot结果表明,在2%半乳糖诱导下,重组酵母WAT11-pJL-AS1+AO1能够表达与预期大小相符的IpAS1蛋白和IpAO1蛋白。GC-MS分析结果显示,仅表达IpAS1基因的重组酵母产生了熊果烷和齐墩果烷,而共表达IpAS1和IpAO1基因的重组酵母合成了熊果酸和齐墩果酸。因此,IpAO1编码一个熊果烷及齐墩果烷的C-28位氧化酶。3、密码子优化与过表达tHMGR提高重组酵母合成熊果酸的产率应用密码子优化技术,获得密码子优化后的IpAS1基因(命名为opIpAS1)和IpAO1基因(命名为opIpA01),转化酿酒酵母WAT11,获得重组酵母WAT11-pJL-opAS1+opAO1。GC-MS检测结果显示,密码子优化后,重组酵母生成熊果酸的产率提高了 3.84倍。将质粒pJL-tHMGR转化重组酵母WAT11-pJL-AS1+AO1,获得重组酵母WAT11-pJL-AS1+AO1/pJL-tHMGR。同时,将质粒 pJL-AS1+AO1 转化酵母 WAT11-T(WAT11,trp1::PGAP1-SctHMGR1-TCYC1,Cas9-NAT),获得重组酵母WAT11-T-pJL-AS1+AO1。GC-MS检测结果显示,与重组菌株WAT11-pJL-AS1+AO1相比,增加了tHMG 基因拷贝数的两个新的重组酵母的熊果酸产率,分别提高了 2.07倍和3.36 倍。结论:本研究成功鉴定了一个毛冬青三萜C-28位氧化酶基因IpAO1,它能够催化熊果烷和齐墩果烷生成相应的熊果酸和齐墩果酸。密码子优化技术和过表达酵母体内MVA途径的tHMGR基因都有利于重组酵母生成熊果酸和齐墩果酸。
【图文】：
三菇皂昔母核形成相关的环化反应
ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅｓ，邋ＣＹＰ４５０，简称邋ＣＹＰｓ）氧化、糖基转移酶（Ｕｒｉｄｉｎｅ邋５＇－ｄｉｐｈｏｓｐｈｏ－逡逑ｇｌｕｃｕｒｏｎｏｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ，ＵＧＴｓ）的糖基化等后修饰过程，，最终形成种类众多的单体逡逑皂苷［１８］，如图２所示。逡逑３逡逑
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S567.19
【参考文献】
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本文编号：
2615233
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