苹果TFIIE、ACBP4和MAP70-1基因的克隆与功能鉴定

发布时间：2020-04-05 17:43

【摘要】：本试验以苹果砧木M26为材料,在前期磷酸化蛋白组学测序的基础上,筛选出TFIIE(General transcription factor IIE subunit 1-like)、ACBP4(Acyl-CoA-binding domain-containing protein 4)和MAP70-1(Microtubule-associated protein 70-1-like)差异蛋白,再通过RT-PCR法克隆TFIIE、ACBP4和MAP70-1基因,同时构建植物双元表达载体,利用农杆菌介导法将上述三个基因成功导入WS Columbia拟南芥(Arabidopsis thaliana)植株中,并应用PEG胁迫对TFIIE、ACBP4和MAP70-1基因进行功能鉴定。主要研究结果如下:1.克隆得到TFIIE、ACBP4和MAP70-1基因,基因登录号分别为MG878870、MG878871、MG878872。TFIIE和ACBP4基因,片段大小分别为1413 bp、2016 bp,均与白梨氨基酸序列同源性最高,分别为97.87%、94.82%;MAP70-1基因片段大小为1860bp,与草莓MAP70-1氨基酸序列同源性高达91.20%。2.荧光定量PCR显示,M26苹果盆栽苗在持续控水20 d、40 d和60 d时,TFIIE的表达水平均上调;ACBP4的表达水平下调;MAP70-1的表达相对稳定。3.构建组成型启动子35S驱动的植物双元表达载体,并成功转化农杆菌EHA105,命名为pBI121/TFIIE/EHA105、pBI121/ACBP4/EHA105、pBI121/MAP70-1/EHA105。4.分别转化获得3个基因的转基因T_2代拟南芥植株。经15%PEG胁迫处理,转基因拟南芥中TFIIE基因上调2.35倍,ACBP4基因下调1/3,MAP70-1基因与对照无显著性差异。这3个基因的T_2代转基因种子在PEG胁迫下的萌发率分别为90.3%、76.23%和88.66%,成活率分别为79.68%、28.30%和54.35%。
【图文】：

甘肃农业大学 2018 届硕士学位论文杂带污染，将扩增片段从凝胶中回收，用于下一步的试验。目的片段与M-T 载体连接之后，转化为重组子，利用 α-互补选择法筛选纯化，在涂有l、IPTG、Amp 的平板上，挑取白色菌落为重组子，蓝色菌落为非重组子，组子摇起的菌液为模板进行 PCR 扩增检测，，获得与目的条带大小一致的单带。测序结果为 TFIIE 基因片段大小为 1413bp，ACBP4 基因片段大小为bp，MAP70-1 基因片段大小为 1860bp。M 1 2M 1 2M 1 2

甘肃农业大学 2018 届硕士学位论文22图2-4 苹果砧木 ACBP4与其他植物 ACBP4同源蛋白的多序列比对分析Fig. 2-4 Mutiple sequence alignment analysis of ACBP4 with ACBP4 homologs from other plants将 MAP70-1 编码的氨基酸序列与相近物种的氨基酸序列进行多序列比对分析（图 2-5），结果显示 MAP70-1 与其他物种的总相似度达到 90.74 %，与苹果（Malus x domestica XM_008390949.2）的同源性最高，为 95.48 %；与甜樱桃（Prunus avium XM_021965382.1）的同源性为 94.38 %，与桃（Prunus persicaXM_007221942.2）的同源性为 94.22 %，与草莓（Fragaria vesca XM_004297386.2）的同源性为 91.20 %，与葡萄（Vitis vinifera XM_002284868.3）的同源性为83.05 %，与甜橙（Citrus sinensis XM_006469189.2）的同源性为 83.23 %。苹果 Malus x domestica白梨 Pyrus
【学位授予单位】：甘肃农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S661.1

【参考文献】

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本文编号：2615323