【摘要】：小麦根腐病是由多种病原菌引起的世界性土传病害,不同地区病原菌差异较大,麦根腐平脐蠕孢是黄淮麦区小麦根腐病的病原菌。目前对麦根腐平脐蠕孢的形态、分类等方面已进行广泛研究,但对其致病分子机理研究很匮乏。本论文通过遗传学方法分析分泌蛋白CsSp3和CsSp4在病原菌致病中的作用,为麦根腐平脐蠕孢的致病机理奠定基础,为麦根腐平脐蠕孢的有效防控提供一定的依据。分泌蛋白在病原菌与植物互作系统中扮演着十分重要的角色,通过对植物病原分泌蛋白功能及其作用机制的研究极大地促进了对植物致病性的了解。通过对麦根腐平脐蠕孢与小麦互作的转录组分析,鉴定到4个具有相同表达模式且在侵染阶段诱导表达的基因。分析其蛋白结构发现均具有分泌蛋白典型的特点,包括N端典型的信号肽结构及多个糖基化和丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸磷酸化位点,由此初步判定为分泌蛋白,并分别命名为CsSP1(Cochliobolus sativus Secreted Protein gene 1)、CsSP2、CsSP3、CsSP4。前期获得CsSP1基因缺失突变体菌株,其致病性丧失,由此推测其他的分泌蛋白可能也具有类似的功能。本研究分析了CsSP3和CsSP4在麦根腐平脐蠕孢侵染过程中的功能,主要结果如下:采用反向遗传学的研究思路,利用split-marker方法构建含有HYG(潮霉素磷酸转移酶基因)基因的敲除盒,通过PEG介导的原生质体转化和体内同源重组得到抗潮霉素的转化子。利用PCR初步筛选,经Southern验证,获得CsSP3基因的缺失突变体。CsSP3基因及上游1.6kb启动子区域共同构建到3′端含有GFP序列的pKNTG载体上,转入(35)cssp3突变体中,获得基因互补的转化子。生物学性状测定结果显示,与野生型和互补菌株相比,(35)cssp3在菌落形态、菌落生长速度和产孢量方面没有明显差别。而利用分生孢子接种小麦和大麦叶片及小麦胚芽鞘,结果显示(35)cssp3虽然能侵染发病,但在叶片和胚芽鞘上形成的病斑明显减小,说明(35)cssp3参与麦根腐平脐蠕孢的致病性;盆栽接种实验结果显示,(35)cssp3突变体和CK对照的小麦的地上和地下部分的生长量没有明显差别,但野生型菌株明显抑制小麦根部伸长,显示(35)cssp3突变体抑制小麦营养生长的能力下降,表明CsSP3基因与麦根腐平脐蠕孢对小麦叶片和茎基部的致病性有关,可能参与侵染小麦根部的次生代谢过程,进而抑制寄主小麦根的伸长。为了明确CsSP3编码产物的亚细胞定位,构建了RP27强启动子驱动的CsSP3-GFP过量表达载体,转化野生型菌株,通过对其分生孢子、芽管、营养菌丝和洋葱表皮模拟侵染的附着胞和侵染菌丝的荧光检测发现,CsSp3-GFP融合蛋白定位于液泡内,通过尼罗红染色证实CsSp3-GFP融合蛋白与液泡中的脂滴共定位,在幼嫩分生孢子、芽管和附着胞中多在聚集融合的大脂滴上,侵染菌丝的脂滴小且较分散,推测CsSP3可能与脂肪代谢和甘油运输至附着胞维持侵染膨压有关。综合上述结果,推定的具有编码信号肽分泌蛋白的CsSP3基因与麦根腐平脐蠕孢对寄主叶片的致病性有关,并参与某种次生代谢过程来抑制小麦根部生长,编码产物定位于液泡并与脂滴共定位,可能与脂肪氧化和产物转运有关,为麦根腐平脐蠕孢的生长提供能量,并维持附着胞高膨压,有利于突破寄主小麦的第一道防御屏障,建立寄生关系。同样的策略,成功获得CsSP4基因的敲除突变体,但突变体在菌落形态、生长速度、产孢量及致病性方面与野生型没有明显差别。
【图文】：
河南农业大学硕士学位论文病的小麦植株也会产生新的分生孢子，通过刮风或者下雨的方式进行传播并侵染其麦植株，加重病害。当麦子成熟时，收获带有麦根腐平脐蠕孢的种子和残留在病残、土壤中的菌丝体或分生孢子将会继续对第二年的小麦造成侵染[17]。据报道，麦根蠕孢的分生孢子可以在土壤中存活，且在不同地区的土壤中存活时间不一，在巴西的麦根腐平脐蠕孢分生孢子甚至可在土壤中存活 37 个月[18]。
河南农业大学硕士学位论文根腐病已成为黑龙江省的第二大病害[9]。近年来，由于秸秆返田措施的的改变和气候条件的变化[28]，小麦根腐病在我国呈现不断加重的趋势，已经成为了小麦生产上的重要问题[29]。根腐平脐蠕孢致病的分子机制研究腐平脐蠕孢能侵染寄主植物的根、茎、叶、穗和籽粒等多个部位[30,31]。-2 中，分生孢子分泌粘液，粘附在小麦穗部内表面，并从分生孢子的两，，芽管延伸并产生多重分支，分支顶端分化出附着胞的侵染结构，大量侵染钉直接穿透寄主表面角质层，侵入菌丝在寄主细胞内和细胞间延长从气孔等自然孔口侵染的现象[32]。为进一步了解麦根腐平脐蠕孢侵染禾制，建立了二倍体短柄草—根腐平脐蠕孢病原菌的互作模型，麦根腐平的相互作用研究为探讨与六倍体小麦互作提供了方便的互作模式[33]。
【学位授予单位】：河南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S435.121.47
【参考文献】
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本文编号：
2615358
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