参与秀丽隐杆线虫对铜绿假单胞菌PA14逃避的新基因筛选和功能鉴定

发布时间：2020-04-07 12:00

【摘要】：生物体多生活于纷繁复杂的环境,如何面对复杂各异环境并做出正确有效的应答,这是其必须面对的问题。通常生物体的感觉调控对其感知、行为、应答以及生存都是非常重要的。逃避行为是机体应对有害环境重要且有效的防御机制之一。逃避行为作为一种常见的神经生物学行为模式,目前在该方向的分子机制研究报道并不全面,且已报道的相关途径或神经元也不足以完全解释生物体的逃避行为。故本研究以秀丽隐杆线虫作为模型,研究病原细菌所诱发的逃避行为及其机制,这对于理解生物体如何应对复杂各异的外界环境具有重要意义。秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)具有通体透明,生活周期短,生理结构简单,易于培养,适合高通量筛选,易于遗传操作等生物学优势,是目前生物学研究领域当中的重要模型之一。在其它动物模型中具有毒力的致病基因在线虫中同样被证明是有效的;而人类的许多细菌病原体,如铜绿假单胞菌PA14,也能有效侵染线虫,因而秀丽隐杆线虫也常被认为是研究微生物致病机制和宿主应答反应的一种简便而经济的模型宿主。WNT信号途径中的配体是一种分泌的脂质修饰的糖蛋白,可与细胞表面受体Frizzled(Fz)结合,结合过程主要通过高度保守的丝氨酸残基和半胱氨酸残基发生共价连接。如果配受体结合后不产生β-catenin在细胞中累积,则被称为非经典WNT信号途径。非经典WNT信号途径常参与细胞的极化,细胞内钙离子变化等生理学过程,但是非经典WNT信号途径是否会介导线虫逃避的神经生物学行为却目前尚不清楚。因此该研究以秀丽隐杆线虫作为研究对象,利用铜绿假单胞菌PA14进行逃避实验,采用RNAi、神经元回复表达、荧光注射、线虫杂交等实验手段,检测非经典WNT信号途径中不同基因对线虫病原逃避行为的影响,为更好阐述逃避这种重要神经生物学行为的分子机制奠定基础。本文研究中得到的主要结果包括:1、WNT信号途径的配体cwn-1和受体mig-1参与了线虫对铜绿假单胞菌(PA14)的逃避。我们的研究以秀丽隐杆线虫作为研究对象,利用富含铜绿假单胞菌的平板来进行逃避实验,对WNT信号途径中配体和受体进行筛选,我们发现WNT信号途径配体cwn-1和受体mig-1突变后的线虫,加入到铜绿假单胞菌的小板中,其逃避指数增加,这说明WNT信号途径配体cwn-1和受体mig-1参与了线虫对铜绿假单胞菌的逃避。2、PLC信号途径中plc-1、plc-3、egl-8、itr-1参与线虫对病原细菌PA14的逃避。我们发现PLC途径中的plc-1、plc-3、egl-8、itr-1突变后的线虫,加入到铜绿假单胞菌的小板中,其逃避指数增加。因为PLC途径位于非经典WNT途径下游,这说明非经典WNT信号途径下游PLC途径中的plc-1、plc-3、egl-8、itr-1抑制线虫对铜绿假单胞的逃避。与此同时我们发现,磷脂酶C家族基因plc-2是不参与线虫对铜绿假单胞的逃避的。另外我们发现非经典WNT途径下游的PKC途径是不参与线虫对铜绿假单胞的逃避的。3、WNT信号途径和PLC信号途径上下游关系的研究我们发现WNT信号途径配体cwn-1和受体mig-1对PA14的逃避表型和PLC信号一致,因而我们在非经典WNT信号途径的配体cwn-1中加入了磷脂酶c家族基因plc-1的激动剂,并统计了其逃避指数。我们发现cwn-1加过磷脂酶c家族基因plc-1的激动剂后,其逃避指数是介于cwn-1单独突变株和单独用磷脂酶c家族基因plc-1的激动剂处理的N2逃避指数之间。据此,我们猜测,究竟plc-1激动剂在整体动物中作用是否完全,抑或是非经典WNT途径下游可能部分通过PLC途径起作用或者其他途径起作用,这有待进一步研究。4、荧光共注射实验研究发现cwn-1表达位置在线虫头部神经元。通过显微注射的方法,在线虫体内观察cwn-1、mig-1、egl-8启动子驱动下mCherry红色荧光的表达,并与线虫株tph-1::GFP进行共定位观察。结果发现,tph-1基因主要是在线虫头部神经元ADF和NSM中表达,而上述三个基因中cwn-1表达位置在头部神经元,但无法与TPH-1共定位。本文的创新之处:首次确定了参与秀丽隐杆线虫病原逃避的新基因cwn-1、mig-1、plc-1、egl-8、plc-3、itr-1。非经典WNT途径下游可能部分通过PLC途径起作用。
【图文】：

成年秀丽隐杆线虫的解剖结构

参与秀丽隐杆线虫对铜绿假单胞菌PA14逃避的新基因筛选和功能鉴定

线虫成年雄虫解剖图
【学位授予单位】：云南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：Q756

【参考文献】