假眼小绿叶蝉海藻糖酶基因的克隆及表达研究

发布时间：2020-04-10 22:49

【摘要】：假眼小绿叶蝉Empoasca vitis(G(?)the)广泛分布于我国各个茶区,是最重要的茶叶害虫之一。该虫防治困难,主要依靠化学农药防治,导致了严重的“3R”问题,因此迫切需要寻找其它防治方法。昆虫海藻糖酶是滞育激素调节与几丁质合成过程中的关键酶,对昆虫生长发育具有重要意义。本研究利用RACE技术和荧光定量PCR技术,不仅克隆得到了假眼小绿叶蝉海藻糖酶基因,明确了其表达情况,同时为防控叶蝉提供了新的思路,为最终发展持续控制害虫的新技术奠定基础。本论文的主要内容及结果如下:(1).假眼小绿叶蝉内参基因的筛选在假眼小绿叶蝉转录组数据中筛选了5种内参基因(18S,ACT,EF1α,RPL10,α-TuB)设计其特异性引物,运用荧光定量PCR技术检测不同处理(不同发育阶段、低温胁迫处理、饥饿胁迫处理、不同农药浓度处理)下的假眼小绿叶蝉5个内参基因的稳定性,并使用geNorm、NormFinder、Bestkeeper、ΔCt法以及RefFinder软件对内参基因的可靠性进行分析。结果表明,在不同发育阶段下,RPL10和EF1α的稳定性最好;在农药胁迫下,18S和ACT是最好的内参基因组合;在饥饿胁迫下,EF1α和RPL10是表达最稳定的两个基因;在低温胁迫处理下,RPL10和EF1α是稳定性最好的基因。(2).假眼小绿叶蝉海藻糖酶基因的克隆与分析通过RACE技术获得海藻糖酶基因cDNA全长为2469 bp,其中包含开放阅读框ORF 1797 bp,一共编码氨基酸642个,起始密码子和终止密码子分别为ATG、TAG。序列中含有海藻糖酶基因的经典标签序列“PGGRFREFYYWDSY”和“QWDYPNAWPP”以及一个甘氨酸富集区“GGGGEY”。预测编码蛋白分子量为74185.44,理论等电点为5.80,不稳定系数为38.91,分子式为C_(3361)H_(5091)N_(869)O_(972)S_(30),脂肪总数为77.59,总平均亲水性-0.381。该氨基酸序列和已经公布的其他昆虫海藻糖酶基因有很高的相似性。经分析发现该基因预测存在两个得分较高的跨膜区,因此该海藻糖酶基因为膜结合型海藻糖酶,并将其命名为EvTre2。(3).假眼小绿叶蝉海藻糖酶基因在不同处理下的表达分析海藻糖酶基因在不同处理下均有所表达。且在低温胁迫处理下,各个低温处理下的海藻糖酶基因表达较未处理成虫相比均有所提高,在4℃处理一小时的样品中表达量达到最高。在农药处理胁迫中,经三个农药浓度处理的样品的海藻糖酶基因表达量均有所提高,并且在浓度3000 mL/公顷时达到了最高。在不同发育阶段下,若虫的表达情况较成虫有所下降。在饥饿胁迫处理下,各个时长饥饿处理均有所提高,特别在饥饿60 h的样品中表达量大幅提高。结果显示EvTre2与假眼小绿叶蝉的抗逆性机制有着极为密切的关系。综上所述,本研究首次成功地从假眼小绿叶蝉中克隆得到膜结合型海藻糖酶基因,并对其进行了生物信息学分析以及表达分析,为进一步深入研究海藻糖基因在假眼小绿叶蝉中的的作用奠定基础,为防治假眼小绿叶蝉提供了新的思路。
【图文】：

技术路线图,实验思路,技术路线

软件对 5 对内参基因进行筛选，扩增获得 E. vitis 海藻糖酶基因对序列进行生物信息学分析。对假眼小绿叶蝉在不同发育阶段酶基因进行表达分析，以验证假术路线如图 1.1。杭州茶区假眼小绿叶蝉样本的采集提取不同处理下的假眼

琼脂糖凝胶电泳,条带,小绿叶蝉,序列比对

23 RNA 琼脂糖凝胶电泳图 (M：DL2000 mark带)l electrophoresis of Empoasca vitis’RNA(M：DL2 ：RNA)条内参基因的克隆小绿叶蝉 cDNA 为模板,经 5 对内参基因引列，分别为 18S 为 180bp，，ACT 为 224bp，TuB 为 190 bp 的目的片段 (图 3.2)，目的条后续试验。测序结果经 Blast 序列比对分析源性为 99%。
【学位授予单位】：中国计量大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S435.711

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