甘蓝型油菜株型及角果长度相关miRNA和靶基因的挖掘

发布时间：2020-04-11 00:00

【摘要】：microRNAs(miRNAs)是一类21-24nt的内源非编码小分子RNA,参与调控植物的发育、衰老、死亡及对各种逆境胁迫响应等。株型是一个重要的农艺性状,与作物的育种潜力,产量,收获方式息息相关。虽然有很多基因被报道参与调作物控株型,但是油菜中miRNA参与株型调控的研究还不多。本研究通过高通量测序手段对顶端组织和早期发育的角果中的miRNA和靶基因进行挖掘,以期对株型调控的分子机理有一定了解,结果如下:1.矮杆紧凑型甘蓝型油菜株型相关miRNA及靶基因的挖掘本课题组发现了一种棒状株型油菜突变体,其具有重大的育种潜力。以回交后代中矮杆紧凑株型油菜突变体(rodlike)和正常株型油菜(normal)为实验材料,对其茎顶端进行四个s RNA组学测序(两次生物学重复)和两个降解组测序,挖掘参与调控株型的miRNAs。对高通量测序结果进行生物信息学分析,最终在四个小RNA文库中共检测到了925个miRNA前体;进一步分析发现315个miRNA前体对应着74个已知的miRNA归属于38个miRNA家族,610个miRNA前体归属于327个新的miRNA。对MIRNA家族成员进行分析,发现miR169家族成员最多,其次是miR156家族,并发现一些miRNA家族成员在基因组上呈现串联重复或者随机复制事件。差异miRNA分析结果得到5个已知miRNA和4个novel miRNA在棒状突变体中显著上调表达;另外,5个已知miRNA和3个novel miRNA在棒状突变体中显著下调表达,并通过实时定量验证了miRNAs表达与测序结果一致。利用降解组测序鉴定到408个靶基因,其中25个已知miRNA家族的264个靶基因和58个novel miRNAs对应的144个靶基因。通过5′RACE验证了7个已知miRNA和1个novel miRNA的14个靶基因,证明降解组测序结果的可靠性。同时,挑选了4个差异miRNAs及其靶基因分析它们之间的关系,发现它们呈负相关性,表明miRNA-target在顶端起作用。进一步分析表明,营养元素/金属离子匮乏,能量供应不足,衰老/早熟机制,还有miR319/miR164调控的TCP转录因子参与的分生组织活动可能导致顶端分生组织的提前终止。更重要的是转基因结果表明TCP4基因能抑制顶端的生长,导致顶端终止发育。因此,我们推测miR319调控的TCP转录因子可能对双子叶植物株型的调控起重要的作用。此外,本研究中预测到的novel miRNA的功能为油菜中miRNA的研究提供了大量有用数据。2.甘蓝型油菜角果长度相关miRNA的挖掘本研究对回交后代中长角果(LS)和短角果(SS)材料开花0-7天的角果进行小RNA测序,构建了4个小RNA文库(两次重复)。测序结果总共鉴定到814个miRNA前体,其中255个前体代表36个miRNA家族的65个已知miRNA,559个前体代表394个novel miRNA。研究发现novel miRNA中有一些是已知miRNA的变异,如novel_mir_65和novel_mir_80与bna-miR164只有4个碱基差异,推测novel miRNA在进化上会越来越少,逐渐趋向于已知miRNAs。长短角果材料中的差异表达分析显示17个miRNAs在LS和SS中存在显著差异,进一步通过qRT-PCR验证了9个miRNA定量结果与测序结果基本一致。构建了LS和SS两个降解组文库,总共鉴定到522个剪切事件,包括33个已知miRNA介导的371个剪切事件和58个novel miRNA介导的151个剪切事件,且5′RLM-RACE验证的结果与降解组测序结果相符。进一步分析了5个差异表达的miRNAs及其靶基因在两个材料0,3,5,7 DAP角果中的动态表达模式,其中miR160和novel_mir_11在角果发育的各个时期都下调表达,表明这些miRNAs可能对角果发育起重要作用。进一步研究证实miR160在角果中有活性,并且在油菜中超量表达miR160抑制生长素响应因子的表达,转基因植株生长旺盛,角果长度增加,揭示了角果长的发育可能是通过生长素的响应途径调控。总的来说,我们推测miR159、miR319和novel_mir_11可能通过抑制细胞分裂,miR160通过调控生长素响应来影响角果发育;而miR2111、miR399、miR827和miR408反映了角果发育过程中磷、铜元素的供应不足,导致营养元素的缺乏对角果发育起到了限制作用。
【图文】：

图 1.1 芸薹属 6 个物种间的亲缘关系（禹氏三角）绿色代表 A 染色体，红色代表 B 染色体，蓝色代表 C 染色体。.1 Genetic relationships between the six species of Brassica(triangosomes from A, B and C genome are represented by green, red and blue colours,想作物株型的意义想株型的研究进展物地上部分的综合体现，主要受基因与环境的共同影响蘖/分枝角度、分蘖/分枝数目和长度、花器官形态以及角一个非常复杂的综合性状，对作物育种潜力起关键作用02)。作物株型反映了植株形态特征和空间排列方式，是区征之一。植物株型直接影响了植株间和植株内对光，气和种环境（病虫害、风）的抵抗能力。合理的株型可以增加

V/WUS(CLAVATA/WUSCHEL)途径是茎顶端分生组织最重要的调控机制之一，构成了负反馈调节机制，保证了分生组织的增殖与分化(Schoof et al 2000)。此外胞分裂素通路基因对 WUS 也起重要的调控，WUS 也可直接抑制细胞分裂素负因子；同时，细胞分裂素还受生长素的负调控，生长素与细胞分裂素的平衡对茎顶端分生组织的增殖与分化起重要作用。另一个维持拟南芥顶端分生组织调控因是 STM，STM 编码一种 homeodomain 蛋白，，是 knotted1(kn1)基因家族的一员有转录调控功能(Long et al 1996)。研究表明 STM 基因能够抑制细胞分化，是顶生组织维持所必需的，异位表达 STM 可以诱导细胞分裂素合成基因 IPT7 引起分裂素增加，促进细胞分裂(Endrizzi et al 1996)。STM 的突变同样能导致 SAM失，而外施细胞分裂素可以部分恢复 stm 突变体的表型；STM 和 WUS 共同参M 的形成与维持，两者具有互补性(Lenhard. et al 2002)。另外，有研究表明表传修饰对将顶端分生组织的关键基因进行重编程，如水稻 WOX11 与 H3K27甲基化酶 JMJ705 结合，降低甲基化水平，促进茎顶端的正常生长(Cheng et al 20
【学位授予单位】：华中农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S565.4


本文编号：2622872