白桦BpMYB21和BpMYB61基因的克

发布时间：2020-04-11 13:13

【摘要】：白桦三萜因其具有的抗肿瘤和抗艾滋病毒等活性,而成为最有潜力的药物制剂,具有重要的应用前景。转录因子具备通过调控途径基因的表达量,进而调节次生代谢物质产量的功能,是常用的从整体改造代谢途径的一种有效工具。本研究以白桦(Betula platyphlla Suk.)为材料,结合实验室前期筛选的响应MeJA和SA信号的MYB转录因子基因,拟克隆与白桦三萜合成相关的BpMYB21和BpMYB61基因全长及启动子序列,并进行生物信息学分析,表达特异性分析,研究其在白桦和酵母中的表达特征及功能。以期为白桦三萜类物质代谢工程遗传改造和生物技术利用提供技术支持和理论依据。本研究结果如下:1.利用特异引物和RT-PCR技术,从白桦组培苗cDNA中克隆了白桦BpMYB21和BpMYB61基因的cDNA全长。通过生物信息学分析发现,BpMYB21基因的ORF全长为1014 bp,编码337个氨基酸,该蛋白质具有一个MYB binding site和两个SANT超家族,为亲水性蛋白,与胡桃MYB30-Like具有64%的相似性,与胡杨MYB86的相似性为61%。BpMYB61基因的ORF长为1203bp,编码400个氨基酸,具有两个MYB binding site保守结构域,为亲水性蛋白,与光皮桦myb-Like的同源性最高为97%。系统进化树表明,BpMYB21转录因子与胡桃,而BpMYB61与光皮桦MYB基因在一个分支上。进一步分析表明,本研究获得的BpMYB21是白桦MYB家族中的新成员。2.利用Real-time PCR技术,分析了BpMYB21和BpMYB61基因时空及激素处理表达模式。结果表明,在六月中旬至九月中旬期间,三年树龄的白桦植株中,BpMYB21和BpMYB61基因均在7、8月份表达量较高。两个基因的组织特异性表达分析表明,茎和叶中的表达水平显著高于根中的表达水平。BpMYB21和BpMYB61两个基因对不同激素诱导的响应模式差异显著。在叶中,除ABA和GA处理12h时BpMYB21基因的表达量最高,其余处理均为6h时BpMYB21基因表达量最高;在茎中,ABA和乙烯在处理12h时BpMYB21基因的表达量达到最高,其余处理均为6h时BpMYB21基因的表达量达到最高。在叶中,除了乙烯和伤害处理6h,BpMYB61基因的表达量最高外,其余处理均在12h,基因的表达量达最高;在茎中,ABA、MeJA、SA的处理使BpMYB61的表达量下调,而GA、乙烯、伤害处理上调BpMYB61基因的表达。通过亚细胞定位实验,明确白桦BpMYB21和BpMYB61在细胞核和细胞膜中均有表达。3.通过染色体步移技术分别扩增得到长度为1302bp和850bp的BpMYB21、BpMYB61基因的启动子序列。这两个基因的启动子序列分析结果表明,BpMYB21和BpMYB61启动子包含TATA盒和CAAT盒等基本元件。同时得到多个植物激素应答元件,如赤霉素、脱落酸、茉莉酸、水杨酸响应元件。还存在干旱、热胁迫、厌氧菌诱导响应元件等防御与胁迫相关的表达元件等。此外发现,BpMYB21和BpMYB61基因启动子序列中还存在MYB转录因子结合的位点MBS元件以及bHLH转录因子的结合位点G-Box元件,暗示两个转录因子之间及与bHLH类转录因子可能存在互作。4.以pYES3/CT质粒为载体分别得到BpMYB21和BpMYB61的酵母表达载体,分别转化INVScl,INVScl-pYES2-SS,INVScl-pYES2-SE酵母菌株。重组酵母细胞中的角鲨烯和总三萜含量分析表明,与对照INVScl-pYES3酵母菌株相比,上述六种重组酵母菌中的角鲨烯和总三萜含量均有不同程度提高,其中BpMYB21重组酵母INVScl-pYES-MYB21-SS角鲨烯含量最高,比对照菌株INVScl-pYES3提高了 89%;在BpMYB61重组酵母INVScl-pYES3-MYB61中角鲨烯含量最高,比对照酵母INVScl-pYES3提高了78%;BpMYB21重组酵母INVScl-pYES-MYB21-SS中总三萜含量比对照酵母INVScl-pYES3提高20%;BpMYB61重组酵母INVScl-pYES3-MYB61总三萜含量比对照INVScl-pYES3 酵母提高 23%。5.利用 pCAMBIA1303-BpMYB21 和 pCAMBIA1303-BpMYB61 农杆菌分别侵染白桦组培苗的叶片、叶柄和茎段,分别获得pCAMBIA1303-BpMYB21和pCAMBIA1303-BpMYB61抗性植株44株和45株,经PCR鉴定分别各获得4株和7株转基因苗。利用实时荧光定量 PCR 检测 pCAMBIA1303-BpMYB21 和 pCAMBIA1303-BpMYB61 转基因白桦苗中均有不同程度上调。在转基因植株MYB21-44中,三萜途径关键酶基因的相对表达量均表现出不同程度的上调,其中上调效果最为显著的是HMGR基因,是对照组的28.24倍;而SE基因的表达量出现了轻微的下调。在转基因植株MYB61-5中,三萜途径关键酶基因FPS和SS的相对表达量出现上调,分别比对照提高了 35%和13%,而HMGR、BPW、SE、BPY的基因表达量均出现不同程度的下调,其中下调效果最为显著的为BPY基因,比对照下调了 84%。暗示两个基因在调控三萜合成中的功能不同。6.从白桦三萜合成关键酶基因中筛选得到6种MYB转录因子结合的顺式作用元件,并成功构建了 pHis-元件的诱饵载体。实验成功的构建了捕获载体pGADT7-Rec2-MYB21和pGADT7-Rec2-MYB61,互作实验结果表明,1号和4号元件分别存在于SE基因启动子和BPX基因的启动子,两个元件与BpMYB21存在微弱的互作,而与BpMYB61存在较强的互作。暗示BpMYB21、BpMYB61对SE基因和BPX基因具有调控作用,而BpMYB61的调控作用可能更强。
【图文】：

萜类,生物合成途径,植物

图１－２植物萜类生物合成途径｜４４］逡逑１．３植物次生代谢途径的调控逡逑植物中有蛋白质等植物初级代谢产物，还有萜类等植物次生代谢产物，，但这些活性逡逑成分在植物中的含量一般都很低｜４５］，因此目前亟待解决的问题就是如何提高植物次生代逡逑谢产物的含量。众所周知，植物次生代谢产物的合成不是一个单一的过程，其中有很多逡逑调控因子发挥着作用，例如生物和非生物因子［４６］。例如，植物萜类次生代谢产物的合逡逑成，不仅受到ＭＶＡ途径多种酶促反应和关键酶基因表达的影响，更受到如茉莉酸逡逑（ＪＡ）、水杨酸（ＳＡ）等激素１４］这类的外源诱导子的诱导以及如转录因子ｂＨＬＨ、逡逑ＷＲＫＹ、ＡＰ２等的调控［４７］。其中，萜类合成的关键酶基因起直接作用，而外源诱导子则逡逑可以间接地调控萜类物质的合成。逡逑１．３．１外源诱导子的调控作用逡逑细胞的信号转导由外源诱导子信号（如病原菌，激素信号等）及与信号分子结合的逡逑受体两部分所启动，下游的靶基因随之被诱导表达，并产生响应的次生代谢产物［４８］。茉逡逑

序列,生物信息学分析,全长克隆,生物信息

ＭＹＢ６１－Ｆ）：邋５＇－邋ＧＣＴＣＴＡＡＡＡＴＧＧＧＧＡＧＧＣＡＣＴ－３，逡逑ＭＹＢ６１－Ｒ）：邋５’－ＴＴＡＡＧＴＡＴＧＴＣＣＡＡＡＧＧＣＣＧＣ邋－３＇逡逑和基因生物信息学分析逡逑ＥｘＰＡＳｙ、ＳＯＰＭＡ等生物信息网站，ＤＮＡＭＡＮ８．０生和办基因的全长ｃＤＮＡ序列及其氨基酸理化特性等分析和预测。逡逑析逡逑／邋ｃＤＮＡ全长克隆及生物信息学分析逡逑２／基因全长的获得逡逑录组数据库基因己知序列两端设计特异引ｃＤＮＡ为模板，ＰＣＲ扩增后，得到的目标扩增条带（性条带的长度为１１１７ｂｐ，命名为办ＧｅＭ逦１逦２逡逑
【学位授予单位】：东北林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S792.153

【参考文献】