咖啡碱生物合成补偿途径关键酶鸟嘌呤脱氨酶的基因克隆及功能验证

发布时间：2020-04-11 10:58

【摘要】：咖啡碱(1,3,7-三甲基黄嘌呤)是一种广泛存在于自然界植物中的黄嘌呤生物碱,最常见的咖啡碱含量高的植物包括咖啡、可可和茶。黑茶渥堆过程中,多种微生物大量繁衍,微生物分泌的胞外酶构成的生化动力、微生物呼吸热构成的物化动力及微生物体内自身代谢造成了茶叶内多种含物的改变,形成了黑茶独特的风味。不同于氨基酸、茶多酚等内含物含量下降,咖啡碱含量呈现一个上升的趋势,这主要是微生物利用自身的代谢作用进行了咖啡碱合成。与植物体内的咖啡碱合成的核心途径不同,微生物体内可能存在一条由鸟嘌呤生成黄嘌呤最终生成咖啡碱的补偿途径。而鸟嘌呤作为微生物体内的基础代谢物可循环积累,且微生物体内腺嘌呤衍生物向鸟嘌呤核苷的转化具有单向性和不可逆性,因此鸟嘌呤水解脱氨生成黄嘌呤是此条补偿路径中的关键步骤。本文尝试对微生物体内咖啡碱合成的补偿途径从理论层面和实际层面进行验证,利用同位素标记法追踪了实际渥堆过程中咖啡碱的生成路径,并对该补偿途径中关键酶基因进行了克隆表达、酶活检测,HPLC法比较了不同微生物、不同启动子、不同表达体系对鸟嘌呤脱氨酶的酶活影响,主要取得了以下结果:(1)茶叶内源酶在黑茶渥堆工艺之前已失活,微生物来源的外源酶成为发酵中最主要的生物催化剂的条件下,咖啡碱含量稳定甚至有上升趋势,黑茶渥堆中的微生物体内存在一条鸟嘌呤生成黄嘌呤生成咖啡碱的路径。(2)以大肠杆菌和酿酒酵母菌体为模板中分别克隆其鸟嘌呤脱氨酶基因EGUD和GUD1,构建重组载体pMAL-GUD1和pMAL-EGUD转化至大肠杆菌中进行表达,在添加鸟嘌呤为底物的情况下,发酵培养120 h后BL21/pMAL-GUD1和BL21/pMAL-EGUD分别合成黄嘌呤浓度为312μg/mL和267μg/mL,不添加底物的条件下,合成黄嘌呤浓度分别225μg/mL和191μg/mL。(3)构建重组载体pRSF-GUD1转入大肠杆菌中表达,含有重组载体pRSF-GUD1的菌株都比含有pMAL-GUD1的菌株对鸟嘌呤的转化率更高。在饲喂鸟嘌呤为底物和不饲喂底物的两种情况下,发酵120 h后重组菌株BL21/pRSF-GUD1比BL21/pMAL-GUD1的黄嘌呤合成率分别高37.5%和23.9%。表明T7启动子比Lac启动子更适合鸟嘌呤脱氨酶的表达。(4)构建重组载体pZ8-GUD1转入谷氨酸棒状杆菌中表达,比较不同表达菌株对GUD1蛋白活性的影响。在添加底物时,C.glu/pZ8-GUD1比BL21/pRSF-GUD1和BL21/pMAL-GUD1的黄嘌呤合成率分别低于44.8%和6.7%,不添加底物时,分别低24.7%和6.7%。结果表明大肠杆菌比谷氨酸棒状杆菌更适合GUD1蛋白的表达,在大肠杆菌中GUD1对鸟嘌呤的转化率更高。本文将为咖啡碱的科学研究和生产提供新思路,阐明黑茶渥堆发酵过程中咖啡碱上升的原因,揭示了咖啡碱合成的补偿途径。
【图文】：

咖啡碱,途径,核心

过程中咖啡碱前期稍有降低到后期再增长的一种趋势；而接种青霉行渥堆发酵时，这些霉菌对咖啡碱的利用能力有限，因此发酵过程持续上升。碱的生物合成途径生长发育中的咖啡碱合成核心途径碱在植物中的研究主要集中在咖啡和茶树上，，自从 19 世纪 20 利用，咖啡碱在植物中的代谢途径的研究便从未停止[32]。后来证明，咖啡碱在各种含咖啡碱植物中合成的核心途径是基本一心途径主要分为四个步骤，分别是甲基化转移酶催化的三次甲苷水解酶催化的一次脱核苷作用[34]，具体途径为如图 1-1 所示。嘌呤环主要来源于嘌呤核苷酸，甲基化过程中的甲基供体则来自于（SAM）。

渥堆,生成路径,咖啡碱

图 2.1 渥堆中咖啡碱生成路径验证Fig2.1 Validation of the caffeine generation path in the pile-fermentin
【学位授予单位】：安徽农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S571.1

【参考文献】